人参皂甙Rb1对感染性休克大鼠重要器官的保护作用*

徐宏平，贾宝辉，艾启帆，孙顾峰，汪嘉飞，刘 浩，刘祥玉，程 舒

1)郑州铁路职业技术学院 郑州 450052 2)南昌大学第四临床医学院 南昌 330003

人参皂甙Rb1对感染性休克大鼠重要器官的保护作用*

徐宏平1)△，贾宝辉1)，艾启帆2)，孙顾峰2)，汪嘉飞2)，刘 浩2)，刘祥玉2)，程 舒2)

1)郑州铁路职业技术学院 郑州 450052 2)南昌大学第四临床医学院 南昌 330003

△男，1965年1月生，硕士，副教授，研究方向：内科急危症，E-mail:1418608464@qq.com

人参皂甙Rb1；感染性休克；Toll样受体4；肿瘤坏死因子-α；大鼠

目的：探讨人参皂甙Rb1对感染性休克大鼠重要器官的保护作用及其机制。方法66只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、Rb1治疗(0.04 mg/g)组，每组22只。模型组和Rb1治疗组大鼠建立感染性休克动物模型。观察3组大鼠肝、肺组织病理变化，检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量和心肌组织Toll样受体4(TLR4)mRNA 表达的变化。结果模型组肝细胞肿胀、变性、坏死，中性粒细胞浸润；Rb1治疗组肝细胞浊肿，轻度变性，未见明显坏死灶，肝血窦中中性粒细胞浸润较轻。模型组部分肺泡上皮细胞肿胀，肺泡隔增宽，毛细血管明显扩张淤血，微血栓形成，肺间质充血水肿，弥漫性中性粒细胞浸润，肺泡腔内大量炎性渗出；Rb1治疗组小血管及毛细血管内中性粒细胞浸润较轻，肺间质轻度水肿，肺泡隔增宽不明显，肺泡腔无渗出物。模型组血清TNF-α、心肌组织TLR4 mRNA水平高于假手术组，Rb1治疗组两指标低于模型组(P<0.01)。结论Rb1可保护感染性休克大鼠肝、肺组织，其机制可能与减少TLR4 mRNA表达水平，抑制TNF-α的产生有关。

脓毒症及其相关病变感染性休克是一组严重的临床综合征，是当前ICU患者多器官功能衰竭和死亡的主要原因，也是危害人类生命健康的一个全球性难题。人参皂甙是人参的主要活性成分[1]，对全身各系统尤其是心血管系统、神经系统有保护作用。Rb1是人参皂甙的主要活性成分[2]。该研究通过探讨Rb1对感染性休克大鼠重要器官的保护作用及其机制，为应用Rb1治疗感染性休克提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组66只健康雄性SD大鼠，体重130～170 g，由南昌大学医学院实验动物中心提供。采用随机数字表法分为假手术组、感染性休克模型组(以下简称模型组)和Rb1治疗组，每组22只。每组中的16只用于观察7 d生存率并记录生存时间，6只用于检测血气、血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、心肌组织中Toll样受体4(TLR4) mRNA和主要组织病理学变化。在造模前30 min，治疗组和模型组分别腹腔注射Rb1(0.04 mg/g)、等量生理盐水，之后每间隔8 h追加注入，共3次。

1.2大鼠感染性休克模型的制备参考文献[3]盲肠结扎加穿孔法制备感染性休克动物模型。以200 g/L乌拉坦(剂量1 g/kg)腹腔麻醉，于前腹正中作长2～3 cm切口，游离肠系膜和盲肠，3-0丝线环行结扎盲肠根部，9号针头于盲端部位穿刺2处，两针孔相距约3 mm，还纳肠管，逐层缝合关腹。术毕，皮下注射生理盐水(30 mL/kg)补充体液，碘伏消毒包扎伤口。假手术组动物除不行盲肠结扎和穿孔外，其余步骤同上。术后大鼠自由进食饮水。

1.3主要试剂注射用Rb1(20 mg/支，上海源叶生物科技有限公司)，大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，RNA提取试剂盒、RNA酶抑制剂(德国Boehringer Mannheim公司)，dNTP、AMV逆转录酶、DNA聚合酶(Taq酶)均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.4主要仪器生命体征监护仪(型号Bene View T5，深圳迈瑞公司)，压力传感器(型号MMBPTSA20，北京天地和协科技有限公司)，450 nm酶标仪(美国Bio-Rad公司)，UV-1601分光光度仪(日本SANYO公司)，DYY-Ⅲ型稳压稳流电泳仪、电泳槽、DYY-7B型转移电泳仪(北京六一仪器厂)，多功能血气分析仪(i-STAT，美国)，基因体外扩增仪(洛阳华美公司)，电热恒温水浴箱(上海医疗器械厂)，凝胶图像分析系统(美国Bio-Rad公司)等。

1.5观察项目及方法记录3组动物造模后7 d内生存率。造模成功后4 h经右侧颈动脉穿刺采集血样，应用血气分析仪测定动脉血血气；取部分血样，加入EDTA抗凝管，离心(3 000g，4 ℃)15 min后，取上清保存于-70 ℃。采用ELISA法测定血清TNF-α水平。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.6大鼠心肌组织中TLR4mRNA的检测造模成功后4 h处死动物取心肌组织，提取组织RNA，采用RT-PCR方法检测心肌组织TLR4 mRNA含量。大鼠TLR4上游引物序列：5’-GTCCATCGGTT GATCTTGGA-3’，下游引物序列：5’-TTAAAAATG GCTGGCAATTCT-3’，扩增产物大小为681 bp。β-actin上游引物序列：5’-ACCACAGCTGAGAGG GAAATCG-3’；下游引物序列5’-AGAGGTCTTTACG GATGTCAACG-3’，扩增产物大小为281 bp。PCR反应条件：93 ℃变性1 min，57 ℃退火2 min，72 ℃扩增1 min，共30个循环。10 g/L琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶图像分析系统进行分析，以目的基因条带与β-actin条带灰度值的比值表示mRNA的相对表达量。

1.7病理学检查造模成功后4 h处死动物取肝、肺组织。石蜡包埋切片，经HE染色后在普通光学显微镜下观察。

1.8统计学处理采用SPSS 13.0进行分析。应用χ2检验比较3组大鼠总体生存率的差异，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较3组大鼠心肌组织TLR4 mRNA和血清TNF-α的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组大鼠总体生存率比较见表1。

表1 3组大鼠总体生存率比较 只(%)

*:χ2=30.378，P<0.001。

2.2 3组大鼠动脉血气分析结果见表2。

表2 3组大鼠动脉血气分析比较

*:与假手术组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

2.3 3组大鼠肝、肺组织病理学改变

2.3.1 肝组织 见图1上排。假手术组肝细胞结构完整，肝小叶形态正常，肝血窦无扩张和炎性细胞浸润。模型组肝细胞肿胀、空泡样脂肪变性，点状或小片状坏死。肝脏门管区局灶性脓肿，肝血窦扩张，中性粒细胞浸润于血管壁。Rb1治疗组肝细胞浊肿，轻度脂肪变性，未见明显坏死灶。肝血窦中中性粒细胞浸润较轻。

2.3.2 肺组织 见图1下排。假手术组肺泡上皮细胞形态正常，肺间隔未见增宽，毛细血管无充血和淤血，肺间质未见出血、水肿及炎性细胞浸润，肺泡大小均匀，结构完整。模型组部分肺泡上皮细胞肿胀，肺泡隔增宽，毛细血管明显扩张淤血，微血栓形成，肺间质充血水肿，弥漫性中性粒细胞浸润，肺泡腔变小，部分区域肺萎缩，肺泡腔内大量炎性渗出。Rb1治疗组小血管及毛细血管内中性粒细胞浸润较轻，肺间质轻度水肿，肺泡隔增宽不明显，肺泡腔无渗出物。

图1 3组大鼠肝(上排)、肺(下排)组织病理学改变(HE,×200)

2.4 3组大鼠血清TNF-α和心肌组织TLR4mRNA水平的比较见表3。

表3 3组大鼠血清TNF-α和心肌组织TLR4 mRNA水平比较

*:与假手术组比较，P<0.01；#：与模型组比较，P<0.01。

3 讨论

内毒素是引起败血症/感染性休克的重要致病因子之一，其化学本质为脂多糖(LPS)。LPS与存在于体内的单核/巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞以及内皮细胞等膜上的受体结合，通过细胞内信号转导机制，启动细胞炎症反应，导致多种炎性细胞因子如TNF-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6等的大量生成，这些炎性细胞因子可进一步作用到其他细胞，引起炎症反应扩大，形成所谓“瀑布效应”，导致全身性过度炎症反应综合征。这一机制是败血症/感染性休克的主要发病机制[4]。

单核/巨噬细胞被激活并释放炎症因子是脓毒症/感染性休克的主要发病机制。当机体受到各种感染或非感染因素刺激后，TNF-α在循环中最早出现并迅速达到高峰，通过激活细胞因子网络系统而诱发全身性过度炎症反应。血清TNF-α含量的高低与多器官功能障碍综合征的发生及其严重程度有良好的相关性[5-6]。

LPS进入体内后主要与CD14、TLRs等结合参与炎症信号的转导[7]。TLRs是一组具有信号转导功能的跨膜蛋白质，广泛分布于动物肝、肺、肾、心、脾等多种组织中。TLRs是完整的LPS信息转导体，目前被认为是主要的LPS功能受体[8]。其中TLR4是介导LPS激活各种免疫效应细胞的敏感受体[9]。

杜晓辉等[10]研究证实，脓毒症可迅速上调心肌组织TLR4、MD-2基因的广泛表达，同时TLR4、MD-2基因表达上调又能促进LPS刺激局部组织合成、释放TNF-α，从而可能共同参与了机体失控性炎症反应的病理生理过程。尹海燕等[11]的研究也证实内毒素血症时心肌组织TLR4表达增加。该研究结果显示感染性休克大鼠4 h血清TNF-α水平明显升高，心肌组织TLR4 mRNA表达亦明显增加。这与感染性休克时内毒素活化心肌细胞内的信号转导通路，促进细胞表面TLR4基因表达上调，从而促进炎性细胞因子的合成有关。

人参是中国传统补气血中药，性味甘平，能补益脏腑之气。人参的主要有效成分为人参皂甙，它具有广泛的药理作用。人参皂甙有30多种, 目前研究较多的有人参皂甙Rb1、人参皂甙Re、人参皂甙Rg1。吕文伟等[12]研究发现：人参皂苷Rg2对结扎冠脉犬所致的心源性休克具有增加心输出量、心脏指数、心搏指数，改善心源性休克犬心功能，有正性肌力作用，而且均能增加血氧含量，改善心肌的供氧。柴惠等[13]研究证实：人参皂甙Rb1可抑制人脐静脉内皮中TNF-α引起的细胞炎症反应的发生。

该研究显示：人参皂甙Rb1治疗可明显提高感染性休克大鼠的存活率，并且还能改善感染性休克大鼠动脉血酸碱度和氧分压水平，明显减轻肝、肺组织的病理损害。提示人参皂甙Rb1对感染性休克动物具有保护作用。作者进一步探讨了这种保护作用的分子机制，结果发现Rb1治疗组血清TNF-α水平与心肌组织TLR4 mRNA表达水平均低于模型组。说明Rb1是通过作用于感染性休克时内毒素活化的细胞内的信号转导通路，抑制细胞表面TLR4基因表达，拮抗炎性细胞因子的合成而实现的。这与吕梦捷等[14]报道人参皂甙Rb1通过抑制内毒素信号转导，调节巨噬细胞因子的分泌、抑制其活化一致。

总之，人参皂甙Rb1可有效拮抗败血症/感染性休克的全身炎性反应综合征，这为将含人参皂苷Rb1成分的中药如三七、人参等更好地应用于临床治疗败血症、感染性休克及多器官功能障碍综合征等提供了新的思路和研究方向。

[1]王春刚,贾晓晶,董丽华,等.西洋参叶三醇组皂苷对乳腺癌放疗患者外周血免疫球蛋白、补体水平及淋巴细胞CD4、CD8和CD25表达的影响[J].吉林大学学报:医学版,2005,31(2):287

[2]Lee SH,Hur J,Lee EH,et al.Ginsenoside Rb1 modulates level of monoamine neurotransmitters in mice frontal cortex and cerebellum in response to immobilization stress[J].Biomol Ther(Seoul),2012,20(5):482

[3]金惠铭.盲肠结扎穿刺后的大鼠败血症模型[J].中国病理生理杂志,1990,6(2):126

[4]Matsuda A,Jacob A,Wu R,et al.Novel therapeutic targets for sepsis: regulation of exaggerated inflammatory responses[J].J Nippon Med Sch,2012,79(1):4

[5]Andrade P,Visser-Vandewalle V,Hoffmann C,et al.Role of TNF-alpha during central sensitization in preclinical studies[J].Neurol Sci,2011,32(5):757

[6]Das UN.Critical advances in septicemia and septic shock[J].Crit Care,2000,4(5):290

[7]李亚清,许武林,严建平,等.Toll样受体4及核因子-κB在脂多糖诱导的气道上皮细胞基质金属蛋白酶9表达中的作用[J].解放军医学杂志,2011,36(10):1048

[8]Park BS,Lee JO.Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes[J].Exp Mol Med,2013,45:e66

[9]Parajuli B,Sonobe Y,Kawanokuchi J,et al.GM-CSF increases LPS-induced production of proinflammatory mediators via upregulation of TLR4 and CD14 in murine microglia[J].J Neuroinflammation,2012,9:268

[10]杜晓辉,李荣,徐迎新,等.脓毒症大鼠心肌Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达的变化和意义[J].中华实验外科杂志,2006,23(3):312

[11]尹海燕,韦建瑞,张锐,等.脓毒症大鼠心肌细胞Toll样受体4和炎症因子基因表达的变化及作用机制[J].中国危重病急救医学,2009,21(8):488

[12]吕文伟,刘洁,田建明,等.20-(S)和20-(R)人参皂苷Rg2对心源性休克犬血流动力学和血氧含量的影响[J].中草药,2003,34(3):254

[13]柴惠,袁小凤,沃立科,等.人参皂甙抑制肿瘤坏死因子α介导的内皮细胞炎症反应[J].中国动脉硬化杂志,2009,17(5):359

[14]吕梦捷,曾耀英,宋兵.人参皂甙Rb1对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬及细胞因子和NO分泌的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,27(3):242

(2013-06-09收稿 责任编辑赵秋民)

Protective effect of ginsenoside Rb1 on septic shock rats

XUHongping1),JIABaohui1),AIQifan2),SUNGufeng2),WANGJiafeng2),LIUHao2),LIUXiangyu2),CHENGShu2)

1)ZhengzhouRailwayTechnologyVocationCollege,Zhengzhou450052 2)TheFourthHospitalAttachedtoNanchangUniversity,Nanchang330003

ginsenoside Rb1;septic shock;Toll like receptor 4;TNF-α;rat

Aim: To observe the protective effect of ginsenoside Rb1 on vital organs in rats with septic shock.Methods: The septic shock model was reproduced by CLP. Sixty-six SD rats were randomly divided into three groups(22 in each group): sham group, CLP group and ginsenoside Rb1 group(0.04 mg/g). The liver and lung samples were prepared for observation of pathological changes; the expression of Toll like receptor 4(TLR4) mRNA in myocardial tissue was determined by RT-PCR; the serum tumor necrosis factor-α(TNF-α) was measured by ELISA.Results: In CLP group, pathological results showed swelling, degeneration, necrosis and neutrophil infiltration in the liver cells,which were milder in ginsenoside Rb1 group. Moreover, in CLP group, there were swelling in alveolar epithelial cells, thickening in alveolar septum, expansion and congestion in capillaries, microthrombosis, congestion and edema in pulmonary interstitial, diffuse infiltration of neutrophils and diminished alveolar space with heavy inflammatory exudation,which were milder in ginsenoside Rb1 group.The TLR4 mRNA in myocardial tissue and serum TNF-α in CLP group were significantly higher than those in sham group(P<0.01). The ginsenoside Rb1 group had markedly lower TLR4 mRNA expression and TNF-α level than the CLP group(P<0.01).Conclusion: Ginsenoside Rb1 could protect the liver and lung tissue of septic shock rats through down-regulating the expression of TLR4 mRNA and inhibiting the produce of TNF-α.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.007

*河南省科技厅基础与前沿项目 102300410163；河南省教育厅科学技术研究重点项目 13B320290；南昌大学第十三届“挑战杯”大学生课外学术科技作品

R631