Smo siRNA对人食管癌EC9706细胞凋亡及Smo、bcl-2基因表达的影响*

郭爱叶，丁胭脂，张 虎，张红新，陈奎生#

1)河南省人民医院检验科 郑州 450003 2)河南省肿瘤医院病理科 郑州 450003 3)郑州大学第一附属医院病理科；河南省肿瘤病理重点实验室 郑州 450052

SmosiRNA对人食管癌EC9706细胞凋亡及Smo、bcl-2基因表达的影响*

郭爱叶1)，丁胭脂2)，张 虎3)，张红新3)，陈奎生3)#

1)河南省人民医院检验科 郑州 450003 2)河南省肿瘤医院病理科 郑州 450003 3)郑州大学第一附属医院病理科；河南省肿瘤病理重点实验室 郑州 450052

#通讯作者，男，1964年8月生，博士，教授，研究方向：肿瘤病理，E-mail:chenksh2002@163.com

Smo；bcl-2；食管癌；凋亡

目的：探讨Smo siRNA对人食管癌EC9706细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2表达的影响。方法设计并合成Smo siRNA-3，转染食管癌EC9706细胞后，分别采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中Smo、bcl-2 mRNA和蛋白的表达；采用TUNEL法及流式细胞术检测细胞凋亡，分析凋亡指数(AI)和凋亡细胞比例。以未转染、无关序列siRNA转染和转染试剂的细胞作对照。结果与各对照组相比，Smo siRNA-3转染细胞24、48和72 h后EC9706细胞中Smo、bcl-2 mRNA的表达均明显降低(P<0.05)，以转染72 h降低最显著(P<0.05)。与各对照组相比，Smo siRNA-3转染72 h后细胞中Smo、bcl-2蛋白的表达均明显降低(F=151.310、143.190，P<0.001)，AI增加(F=66.270，P<0.001)，早期和晚期凋亡细胞比例均增加(F=101.100、334.990，P<0.001)。结论Smo siRNA可能通过抑制细胞中Smo基因表达，进而下调bcl-2表达，促进EC9706细胞凋亡。

Hedgehog(Hh)信号通路是调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路，Smoothened(Smo)蛋白是Hh信号通路上的膜蛋白，它把细胞外的Hh信号转换成细胞内的Gli信号, 进而激活Hh相应基因(如bcl-2等)的转录，影响细胞凋亡[1]。该研究中作者观察了RNA干扰沉默Smo基因对人食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡相关基因bcl-2表达及细胞凋亡的影响，以期为食管癌的基因治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料EC9706细胞由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室赠送。LipofectamineTM2000及Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录第一链cDNA合成试剂盒购自Fermentas公司，Quant cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，Smo、bcl-2、β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成，RPMI 1640培养液由北京索莱宝科技有限公司提供，TUNEL试剂盒购自瑞士Roche公司，Smo、β-actin一抗及bcl-2兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。Smo siRNA(包括3条不同的Smo siRNA、无关序列siRNA)由上海吉玛公司合成，序列见表1。

表1 3条Smo siRNA 的序列

1.2细胞培养将EC9706细胞用RPMI 1640培养液(含体积分数10%胎牛血清，青、链霉素各100 U/mL)，于37 ℃、体积分数5%CO2孵箱内培养。

1.3实验分组将EC9706细胞以4.5×105mL-1的密度接种于6孔板中，细胞覆盖率达30%～50%时，利用LipofectamineTM2000分别转染3条Smo siRNA，结果Smo siRNA-3的抑制效率最好，故选择Smo siRNA-3用于实验。实验设Smo siRNA-3转染24、48、72 h组，无关序列siRNA转染组，转染试剂组和未转染对照组，每组5个复孔。

1.4细胞中Smo、bcl-2mRNA的RT-PCR法检测收集上述6组细胞，用Trizol提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR。Smo 上游引物序列为5’-CGCTACCCTGCTGT TATTCTCT-3’，下游引物序列为5’-CAGGTGGAAG TAGGAGGTCTTG-3’,产物大小为306 bp；bcl-2上游引物序列为5’-AACTCGAGTGACAAGCCCGATG-3’，下游引物序列为5’-GTACCACCAGTTGGTTGTCTTT GA-3’,产物大小为201 bp；内参β-actin上游引物序列为5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3’，下游引物序列为5’-GAGCTACGAGCTGCTGCCTGACG-3’,产物大小为416 bp。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，63 ℃(Smo)/68 ℃(bcl-2)/67 ℃(β-actin)退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；72 ℃终延伸5 min。产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，Alpha多功能凝胶成像系统成像，用Alpha View软件进行图像分析，以目的基因与β-actin电泳条带吸光度(A)值的比值表示目的基因mRNA的表达水平。

1.5细胞中Smo、bcl-2蛋白的Westernblot法检测收集Smo siRNA-3转染72 h组、无关序列siRNA转染组、转染试剂组和未转染对照组细胞，经胰酶消化离心，冰上裂解，提取蛋白质，采用BCA法测定蛋白浓度，Western blot法检测Smo、bcl-2蛋白。一抗按1 000倍稀释，二抗按5 000倍稀释。DAB显色。图像分析同1.4，以目的蛋白与β-actin条带A值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.6细胞凋亡检测

1.6.1 TUNEL法 收集Smo siRNA-3转染72 h组、无关序列siRNA转染组、转染试剂组和未转染对照组细胞，制备细胞爬片， 滴加50 μL TUNEL反应混合液，37 ℃避光孵育1 h；滴加Converter-POD 50 μL，37 ℃避光孵育；DAB显色，镜下控制显色时间，苏木素复染。于高倍镜(×400)下选取10个视野，每个视野计数200个细胞，计数视野内凋亡细胞数，求平均数。凋亡指数(apoptosis index,AI)=(凋亡细胞数/200)×100%。

1.6.2 流式细胞术法 收集Smo siRNA-3转染72 h组、无关序列siRNA转染组、转染试剂组和未转染对照组细胞(保证细胞密度>1×106mL-1)。PBS洗涤3遍，用100 μL预冷的Binding缓冲液重悬细胞，加入5 μL FITC标记的Annexin V和5 μL PI混匀避光孵育15 min，再加入400 μL Binding缓冲液混匀后，上流式细胞仪检测。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0进行统计学处理，组间Smo、bcl-2 mRNA和蛋白表达水平及AI、凋亡细胞比例的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 6组细胞中Smo及bcl-2mRNA的表达见图1和表2。可以看出，Smo siRNA-3转染后细胞Smo和bcl-2 mRNA表达水平均较对照降低，以转染72 h降低最显著。

图1 6组细胞中Smo及bcl-2 mRNA的表达

M：DNA Marker；1：未转染对照组；2：转染试剂组；3：无关序列siRNA转染组；4～6：Smo siRNA-3转染24、48、72 h组。

表2 6组细胞中Smo及bcl-2 mRNA的表达

*:与未转染对照组、转染试剂组和无关序列siRNA转染组相比，P<0.05；Smo siRNA-3转染组间两两比较，P<0.05。

2.2 4组细胞中Smo及bcl-2蛋白的表达见图2和表3。可以看出，Smo siRNA-3转染72 h后细胞Smo和bcl-2蛋白表达水平较对照明显降低。

1：未转染对照组；2：转染试剂组；3：无关序列siRNA转染组；4：Smo siRNA-3转染72 h组。

表3 4组细胞中Smo和bcl-2蛋白的表达

*:与未转染对照组、转染试剂组和无关序列siRNA转染组相比，P<0.05。

2.3 4组细胞凋亡检测结果见图3和表4。Smo siRNA-3转染72 h组AI、流式细胞术测得的晚期凋亡细胞和早期凋亡细胞比例均明显大于其他3组。

图3 细胞凋亡TUNEL法染色图(×400)

表4 细胞凋亡检测结果 %

*:与未转染对照组、转染试剂组和无关序列siRNA转染组相比，P<0.05。

3 讨论

近年来的研究[2-7]表明，多种肿瘤的发生和发展与Hh信号通路的异常激活及过表达有着密切的关系，如肺小细胞癌、基底细胞癌、膀胱癌、胰腺癌、髓母细胞瘤、肝癌、前列腺癌、胃癌、乳癌等。通过抑制Hh信号转导通路关键基因进而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡已成为研究热点。

Smo基因是一个原癌基因，位于染色体7q31-7q32，编码一个含有1 024个氨基酸的蛋白。Smo蛋白有3个区域：细胞内羧基端区域、细胞外氨基端区域和疏水跨膜区[8]。当Hh蛋白不存在时，受体蛋白Ptch抑制Smo蛋白的活性，进而阻断Hh信号通路[9]。当Hh蛋白存在时，Hh蛋白与Ptch蛋白结合，解除了对Smo蛋白的抑制，激活的Smo 蛋白可以把细胞外的Hh信号转换成细胞内的Gli信号，进而激活相应基因的转录，包括Hhip、ptch、Gli1、cyclinD、Bmi1、bcl-2等[10]。相关研究[11-15]表明，采用siRNA抑制胃癌MGC803细胞、乳癌MCF-7细胞、肝癌Huh-7细胞、胰腺癌PANC-1细胞中Smo和Gli1的表达，可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，表明Smo可能是肿瘤基因治疗的有效靶点。

前期研究结果表明[16-17]，Smo在人食管鳞状细胞癌及裸鼠食管癌移植瘤组织中高表达；Smo siRNA可通过下调癌细胞中Smo 基因的表达, 诱导裸鼠食管癌移植瘤细胞的凋亡。该研究中作者设计合成了Smo siRNA-3，其可在蛋白和mRNA水平上有效抑制EC9706细胞中Smo和bcl-2的表达；TUNEL法及流式细胞术检测结果显示，Smo siRNA-3转染72 h后，EC9706细胞凋亡明显增加。实验结果说明，沉默Smo基因表达可以促进EC9706细胞的凋亡，该作用可能由bcl-2介导。

综上所述，Smo siRNA沉默Smo基因表达，可通过下调EC9706细胞中bcl-2的表达促进细胞凋亡。Smo有望成为食管癌基因治疗的靶点。

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(2013-08-08收稿 责任编辑王 曼)

Influence of Smo siRNA on apoptosis,Smo and bcl-2 genes expression in EC9706 cells

GUOAiye1)，DINGYanzhi2)，ZHANGHu3)，ZHANGHongxin3)，CHENKuisheng3)

1)ClinicalLaboratory,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003 2)DepartmentofPathology，HenanCancerHospital,Zhengzhou450003 3)DepartmentofPathology，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity;HenanKeyLaboratoryofTumorPathology,Zhengzhou450052

Smo;bcl-2;esophageal carcinoma;apoptosis

Aim: To investigate the influence of Smo siRNA on bcl-2 expression and apoptosis of human esophgeal carcinoma EC9706 cells.Methods: Smo siRNA-3 was designed and synthesized successfully,and then transfected into EC9706 cells.The expression of Smo,bcl-2 protein and mRNA of transfected EC9706 cells were detected by Western blot and RT-PCR,respectively,the apoptosis were detected by TUNEL method and flow cytometry,and apoptosis index(AI) and apoptosis cells proportion were calculated.The cells without transfection,transfected with unrelated sequence siRNA or reagent were the control.Results: Compared with the control groups, the mRNA expressions of Smo and bcl-2 in cells transfected with Smo siRNA-3 for 24, 48 and 72 h decreased(P<0.05),especially in cells transfected for 72 h(P<0.05).Compared with the control groups,the protein expressions of Smo and bcl-2 in cells transfected with Smo siRNA-3 for 72 h decreased(F=151.310,143.190，P<0.001),AI increased(F=66.270，P<0.001),and apoptosis cells proportion was higher(P<0.05).Conclusion: Smo siRNA may decrease the expression of bcl-2 through silencing the Smo expression,thus promote the apoptosis of EC9706 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.001

*河南省科技创新杰出人才基金资助项目 114200510007

R735.1