p-Akt和CDK2的表达与非小细胞肺癌新辅助化疗的相关性研究

薛英杰 谷丽平

·论著·

p-Akt和CDK2的表达与非小细胞肺癌新辅助化疗的相关性研究

薛英杰 谷丽平

目的探讨不同类型癌症中蛋白激酶B(Akt，又称PKB)、周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK2)与非小细胞肺癌新辅助化疗之间的相关关系，为非小细胞肺癌的预后判断及治疗提供依据和指导。方法收集2010年9月至2012年6月收治的120例非小细胞肺癌患者中选出80例非小细胞肺癌患者，以新辅助化疗前穿刺活检病理组织为对照组，试验组为顺铂联合紫杉醇组， 80例患者均为进行新辅助化疗2周期后再行手术的患者。病理标本采用免疫组织化学方法(SP法)及逆转录PCR法检测pAkt和CDK2在新辅助化疗前及手术后的表达变化情况。进一步分析AKT、CDK2的表达与非小细胞肺癌化疗效果之间的相关性。结果新辅助化疗能有效杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤组织的生长，使肿瘤组织缩小，提高临床手术的切除率。免疫组织化学SP法染色表明，新辅助化疗二周期顺铂联合紫杉醇组P-Akt表达均低于新辅助化疗前(P<0.05)。提示pAkt、CDK2表达与化疗疗程负相关，随化疗时间的延长，pAkt、CDK2表达降低(P<0.05)。逆转录PCR法检测Akt与CDK基因的表达新辅助化疗二周期顺铂联合紫杉醇组AktRNA的表达低于新辅助化疗前，CDK2RNA的表达均明显低于新辅助化疗前(P<0.05)。提示AktRNA、CDK2RNA的表达与化疗疗程负相关，随化疗时间的延长，AktRNA、CDK2RNA的表达降低。结论新辅助化疗能有效杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤组织的生长，使肿瘤组织缩小，提高临床手术的切除率。AKT和CDK2作为参与非小细胞肺癌发生发展的重要基因。新辅助化疗能有效降低肿瘤基因AKT和CDK2的RNA及蛋白表达，且随化疗疗程延长及患者联合化疗的应用，AKT基因表达降低，CDK2基因表达的降低更为明显。

p-Akt，CDK；非小细胞肺癌；新辅助化疗

近十年来，肺癌的发病率及死亡率都位居全球之首，世界卫生组织预测，我国将成为世界第一肺癌大国，此外，肺癌尚缺乏有效的早诊早治手段，总的5年生存率低于10%。因此，无论从发病率、死亡率还是预后看，肺癌都是严重威胁人民健康和生命的疾病，已经是我国第一大癌症，成为我国新世纪癌症防治的难中之难，重中之重。在临床工作中，肺癌的病理类型以非小细胞肺癌居多，而小细胞肺癌较少。在非小细胞肺癌中鳞癌和腺癌多见。肺癌的起病隐匿，许多患者在诊断明确时常发生淋巴结转移。前人研究表明，对于中晚期非小细胞肺癌患者，起初不能手术切除的患者经过新辅助化疗后肿瘤组织缩小，可进行手术切除治疗。提高了患者进行手术切除的几率。从而提高患者的生存率和治疗有效率。本试验通过在手术前后分别取肿瘤组织标本研究新辅助化疗对患者病理组织中蛋白激酶B(Akt又称PKB)、周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK2)的表达结果进行比较和分析，为非小细胞肺癌的临床治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院病理科2010年9月至2012年6月非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织160块，其中包括80例化疗前和80例术后肿瘤组织标本石蜡包埋组织。80例非小细胞肺癌患者，均为男性吸烟患者。年龄40～70岁，平均年龄55岁，中位年龄62岁，分期为Ⅲ期。标本的选取有可对照性，取材肿瘤大小一样，先做新辅助化疗使肿瘤缩小后有利于手术的开展。

1.2 分组及化疗 选取鳞癌患者40例，腺癌患者40例。以新辅助化疗前穿刺活检病理组织为对照组，顺铂联合紫杉醇组为试验组，其中顺铂按70 mg/m2，紫杉醇按175 mg/m2计算使用。80例患者均为进行新辅助化疗2周期后再行手术。

1.3 新辅助化疗方法 (1)新辅助化疗前评估患者在入选前详细询问病史并进行细致的查体。然后进行分期检查，包括头部MRI、胸部CT、腹部彩超、浅表淋巴结彩超、全身骨扫描。实验室检查包括血、尿、便常规，肝肾功、血糖、电解质、肿瘤标志物检查。(2)新辅助化疗后疗效及评价方法：疗效：两个最大垂径乘积变化；CR：全部病灶消失，至少维持4周；PR：缩小至少50%，至少维持4周；NC/SD：介于PR 和PD之间；PD：增加超过25%,或出现新病灶。

1.4 试验方法

1.4.1 免疫组织化学SP法染色：对非小细胞肺癌患者p-AKT和CDK2采取免疫组织化学法染色，即采用抗体与抗原特异性结合显色的方法，检测CDK2及p-AKT蛋白质表达状况。判断标准：免疫组织化学结果应用IPP图文分析软件分析。细胞胞浆中有棕黄色颗粒为阳性信号，每个标本切片取10个高倍视野(400倍),综合阳性面积和染色深度计算阳性区域的光密度值(IOD)，以各组的均值进行比较[2]。

1.4.2 另一种方法采用逆转录PCR法检测Akt与CDK基因的表。

2 结果

2.1 新辅助化疗对非小细胞肺癌疗效的观察 80例病例中2周期化疗后完全缓解为3.75%(3/80)；部分缓解为35.00%(28/80)；临床稳定为42.50%(34/80)；临床进展为18.75%(15/80)。经新辅助化疗后部分患者的肿瘤体积变小，可顺利进行手术治疗。

2.2 新辅助化疗对非小细胞肺癌p-AKT蛋白表达的影响 免疫组织化学SP法染色表明，P-AKT主要在胞浆内表达，细胞核内也有少量表达。表现为出现棕黄色颗粒。新辅助化疗二周期顺铂联合紫杉醇组P-Akt表达(0.59±0.09)均低于新辅助化疗前(0.78±0.10)(P<0.05)。提示pAkt表达与化疗疗程负相关，随化疗时间的延长，pAkt表达降低(P<0.05)。

2.3 新辅助化疗对非小细胞肺癌CDK2蛋白表达的影响 免疫组织化学SP法染色表明，CDK2主要在胞浆内表达，细胞核内也有少量表达。新辅助化疗二周期顺铂联合紫杉醇组CDK2表达(0.37±0.06)均明显低于新辅助化疗前(0.84±0.09)(P<0.05)。提示CDK2表达与化疗疗程负相关，随化疗时间的延长，CDK2表达降低(P<0.05)。

2.4 逆转录PCR法检测Akt与CDK基因的表达 新辅助化疗二周期顺铂联合紫杉醇组AktRNA的表达均明显低于新辅助化疗前(P<0.05)。提示AktRNA的表达与化疗疗程负相关，随化疗时间的延长，AktRNA的表达降低(P<0.05)。新辅助化疗二周期顺铂联合紫杉醇组CDK2RNA的表达均明显低于新辅助化疗前。提示CDK2RNA的表达与化疗疗程负相关，随化疗时间的延长，CDK2RNA的表达降低(P<0.05)。

3 讨论

近年来，大量研究表明AKT在肺癌信号通路中起重要的调控作用[1]。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidy linositol-3 kinase,PI-3K)可受多种生长因子激活，为生长因子家族的重要成员。活化的PI3K可以使PIP2变为PIP3，PIP3可以激活磷脂酰肌醇依赖性酶1(3'-phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)，后者可以使AKT活化。PI3K/AKT信号通路诱导细胞增殖和分化，避免发生细胞凋亡。绝大多数抗肿瘤药物都是通过诱发肿瘤细胞凋亡，从而杀死肿瘤细胞。通过药物降低AKT的活化水平能够增加肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性[2]。

基于AKT的分子结构设计选择AKT抑制剂，主要分为如下三种：ATP竞争性抑制剂、PH结构抑制剂、变构抑制剂和底物类似物。GSK690693是一种ATP竞争性抑制剂，在低浓度时对AKT的3中亚型均可抑制，降低下游分子的磷酸化水平。并能增强RB1和FOX01/3的活性，从而抑制Myc和TFRC的活性。缺点是这种抑制剂对所有AGC家族蛋白质均有抑制作用，特异性不强。PH结构抑制剂：派立福新是一种烷基磷脂类抗癌药物，降低AKT的磷酸化水平，从而抑制癌细胞及诱导凋亡，增加其他化疗药物的敏感性[4]。

Akt促进细胞侵袭和转移。活化的AKT通过多种途径调节内皮一氧化氮合成酶(endothelial NO synthase，eNOS)、MMP2及Ps6k等。eNOS促进血管内皮生长因子(VEGF)诱导细胞迁移[5]。

CDK2在细胞周期中作为正向调节因子，与细胞的演变、增殖、分化有关，是原癌基因的一种。CDK2蛋白的表达与淋巴结转移有关。对宣威地区非小细胞肺癌研究表明CDK2在宣威地区的鳞癌和腺癌中的表达均高于正常的组织。且该蛋白与非小细胞肺癌临床分期和组织分化程度无关(P>0.05)。CDK2的表达与P27kip1表达负相关(P<0.05)[6]。

本研究通过对80例非小细胞肺癌患者的病理切片进行免疫组化染色，观察p-Akt、CDK表达和非小细胞肺癌化疗之间的相关性。首先研究Ⅲ期鳞癌和腺癌患者在化疗前穿刺组织的表达情况，然后研究2周期化疗后p-Akt、CDK表达情况，并进行比较。

本研究中，我们观察了新辅助化疗前后所选病例病灶大小的变化，我们发现以上80例病例中， 2期化疗后完全缓解为3.75%(3/80),部分缓解为35.00%(28/80),临床稳定为30.00%(34/80)，临床进展为18.75%(15/80)。经新辅助化疗后一部分患者的肿瘤变小，顺利的进行了手术治疗。

然后，我们用免疫组织化学的检测方法，检测化疗前、2周期化疗后p-Akt、CDK表达水平，结果显示P-Akt表达水平与患者化疗药物负相关。随着化疗药物使用，AKT表达水平逐步降低。二者对比差异显著。免疫组织化学SP法染色表明，CDK2主要在胞浆内表达，细胞核内也有少量表达。CDK2表达水平也与患者使用化疗药物呈负相关，随着化疗药物的使用，CDK2表达水平降低，患者在化疗前后表达水平有显著差异。这说明使P-AKT表达水平降低，联合化疗是有效的。新辅助化疗使肿瘤组织缩小后有利于手术的开展，从而提高手术的成功率及患者的治疗有效率。

综上所述， 新辅助化疗能有效杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤组织的生长，使肿瘤组织缩小，提高临床手术的切除率。AKT和CDK2作为参与非小细胞肺癌发生发展的重要基因。新辅助化疗能有效降低肿瘤基因AKT和CDK2的RNA及蛋白表达，且随化疗疗程延长及患者联合化疗的应用，AKT基因表达略降低，CDK2基因表达的降低明显。

1 Carnero A.The PKB/AKT pathway in cancer.Curr Pharm Des,2010,16:34-44.

2 董自强,江克华,宋兴福,等.抑制PI3K/AKT信号通路提高膀胱癌化疗效果的实验研究.实用医学杂志,2012,28:181-184.

3 张颐，伍丹丹，席红，等.新辅助化疗对晚期卵巢浆乳癌组织PI3K、P-AKT、PTEN表达的影响及临床意义探讨.山东医药,2009，49：76-77.

4 缪小辉,宋勇,吕镗峰,等.AKT2在非小细胞肺癌中的表达及预后意义.中国癌症杂志,2011,21：396-399.

5 蒲绒,李为民,刘丹,等.AKT2及磷酸化AKT2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义.四川大学学报(医学版),2010,41:586-589.

6 金文虎,王达利,聂开瑜,等.增生性瘢痕成纤维细胞中CyclinD1，CDK2，CDK4作用及与细胞周期的相关性.中国组织工程研究,2012,16：4423-4426.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.10.014

073000 河北省定州市人民医院肿瘤科(薛英杰);定州市人民医院肾内、内分泌科(谷丽平)

R 734.2

A

1002-7386(2014)10-1478-03

2013-10-18)