一种快速、简便的模板提取方法用于PCR检测粪便中的金黄色葡萄球菌的研究

付素兰 刘景武 孙文泽

·论著·

一种快速、简便的模板提取方法用于PCR检测粪便中的金黄色葡萄球菌的研究

付素兰 刘景武 孙文泽

目的建立一种快速、简便的模板提取方法用于PCR检测粪便中的金黄色葡萄球菌。方法利用FTA滤膜,无需增菌，直接从人工污染金黄色葡萄球菌的粪便中提取DNA模板，以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因，经过PCR扩增得到279 bp的产物。通过凝胶电泳，和凝胶成像技术观察结果。结果使用FTA滤膜可有效的提取DNA模板，消除了样本中的PCR抑制因子，通过PCR方法检测人工污染的粪便中的金黄色葡萄球菌，检出限为102 cfu/ml，可在6 h内完成检测。结论FTA滤膜用于PCR检测粪便中的金黄色葡萄球菌操作简便、快速。使用FTA滤膜法制备模板DNA,为食源性致病菌快速检测构建了一个技术平台。

PCR；粪便；金黄色葡萄球菌；FTA 滤膜

目前，对于金黄色葡萄球菌有很多检测方法，在应对突发公共卫生事件时，快速准确的判断病原菌，成为诊疗的关键。传统检测方法是可靠，但费力、耗时，不能满足临床诊断的需要。分子生物学方法具有灵敏度高，快速的特点，但必须制备高纯度的模板，而粪便中主要是一些食物残渣如脂肪、植物纤维、蛋白质等，这些抑制因子的存在大大降低了PCR检测的灵敏度，因而，限制了PCR方法在临床检测中的广泛应用。所以，如何制备高纯度的模板成为关键。FTA滤膜能在室温下对各种生物样品进行收集、运输、存档,还可以用于核酸纯化，进行PCR、 SNP、RT-PCR、 RFLP 分析，其最早是用于储存血液样品，FTA 卡是将变性剂和螯合剂渗透在纤维基质上，当捕捉到细胞后能自动将其裂解，DNA吸附在FTA 卡上经干燥后既可长期保存，也可以用专用缓冲液洗涤，去除样品中的杂质、细胞残片，以及其他PCR抑制因子的干扰，可直接作为模板用于PCR反应[1-6]。鉴于FTA 滤膜具有以上优点，本研究以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc为靶序列，使用FTA滤膜直接制备DNA模板，进行PCR扩增来直接检测粪便中的金黄色葡萄球菌。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种：Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)-ATCC6538、ATCC25923、ATCC13565、ATCC14458、ATCC8095。以上菌种分别购自中国普通微生物菌种保藏管理中心和中国医学细菌保藏管理中心。菌种接种于营养肉汤培养基中，37℃，摇瓶过夜培养。

1.1.2 培养基：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基，购自北京市陆桥技术有限公司。

1.1.3 粪便标本为我院临床病人标本，经培养证明无金黄色葡萄球菌生长。

1.1.4 化学试剂：Premix Taq DR004A、DNA Marker DL2000，购自大连宝生物工程公司引物(正向引物,反向引物)由大连宝生物工程公司合成。FTA Filter: 购自 Whatman公司 FTA缓冲液: 购自Whatman公司

1.1.5 实验仪器：PCR仪为Whatman T Gradient基因扩增仪，电泳仪为北京市六一厂生产DXY-33A型电泳仪，凝胶成像系统为华粤企业集团有限公司UVIpro凝胶成像系统，2.00 mm Harris Micro Punch and Mat 购自Whatman公司。

1.2 方法

1.2.1 样品人工污染：便标本为我院临床患者标本，在人工污染金黄色葡萄球菌前，经培养证明无金黄色葡萄球菌生长。取过夜培养的沙门氏菌肉汤培养液，调整菌液浓度为2×101～2×1010cfu/ml，取1 ml加入1 g(1 ml)粪便标本中混匀。

1.2.2 DNA提取：取20 μl人工污染样本滴入加有直径2.00 mm FTA滤膜片的离心管中，然后56℃干燥，干燥后的FTA 滤膜片，加入10% SDS溶液200 μl煮沸10 min，用FTA专用缓冲液洗涤2次，然后再用TE缓冲液洗涤两次，56℃干燥后,可作为PCR反应的模板。

1.2.3 PCR

1.2.3.1 PCR引物：引物序列是根据编码耐热核酸酶基因设计，由大连宝生物公司合成[7]。上游引物序列为(5’-3’)CGATTGATGGTGATACGGTT 279bp引物序列(5’-3’)为AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC。

1.2.3.2 PCR反应体系：总反应体系50 μl。包括25 μl Premix Taq预混液,1 μl 20 μmol正向引物，1 μl 20 μmol反向引物，去离子水23 μl。阳性对照：取过夜培养的金黄色葡萄球菌，10 000×g离心10 min,用去离子水洗涤两次，然后以10 000×g离心10 min，加100 μl去离子水煮沸10 min,14 000×g离心10 min，取2 μl上清液作为模板，加入反应体系进行PCR扩增，扩增结果作为阳性对照。阴性对照：取2 μl去离子水代替模板，加入反应体系进行PCR扩增，作为阴性对照。

1.2.3.3 PCR扩增程序：PCR反应采用冷启动。94℃预变性4 min，再按94℃ 1 min，58℃ 0.5 min，72℃ 1.5 min进行35个循环，最后72℃延伸3.5 min。

1.2.3.4 电泳检测：取10 μl PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并成像。

2 结果

2.1 人工污染的样品检测结果 本研究能直接从人工污染的含有102cfu/ml金黄色葡萄球菌的粪便标本中提取金黄色葡萄球菌的DNA。利用PCR扩增技术，成功的检测出了人工污染的粪便标本中的金黄色葡萄球菌。由图可知检出限是102cfu/ml。见图1。

图1 粪便中金黄色葡萄球菌PCR检测结果

3 讨论

粪便标本主要成分是一些食物残渣，这些抑制因子的存在大大降低了PCR检测的灵敏度，因而，限制了PCR方法在临床检测中的广泛应用。而FTA 滤膜的应用，成功解决了这一问题，FTA 卡是将变性剂和螯合剂渗透在纤维基质上，当捕捉到细胞后能自动将其裂解，DNA吸附在FTA 卡上，通过缓冲液洗涤，去除样品中的其他成分，而吸附了DNA的FTA 卡可直接作为模板用于PCR反应。这一方法，为PCR广泛应用于食源性致病菌引起的食物中毒快速检测奠定了基础，使之真正应用于临床检测成为可能。

目前国内外采用的PCR方法检测致病菌一般都需要进行前增菌，虽然能提高检测的灵敏度，但相应的增加了检测的时间，一般延长12～24 h。本试验采用FTA滤膜直接提取DNA模板，无需增菌，方法操作简便、快速，有效避免了工作人员在处理标本时可能造成的感染。

1 Keith AL,Palmer AO,Leroy K.Improved template preparation for PCR assay for etection of food-brone bacterial pathogens.Appl Environ Microbiol,2000,66:4539-4542.

2 付素兰，刘景武.FTA卡在模板DNA制备中的应用研究.中国卫生检验杂志,2008,18:1124-1125,1150.

3 匡金枝,聂同钢.FTA-DNA直接提取法的研究与应用.中国法医学杂志,2008,23:108-110.

4 鲁巧云,余进.FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鉴定中的应用.中国真菌学杂志,2010,5:137-141.

5 Lois CT，Michelle T，Karl R.Automated forensic DNA purification optimized for FTA card punches and identifiler STR-based PCR analysis.Journal of the Association for Laboratory Automation,2005,10:183-191.

6 Palmer AO，Keith AL.Extraction-Free,filter-based template preparation for rapid and sensitive PCR detection of pathogenic parasitic protozoa.J Clin Microbiol,2000,38:2271-2277.

7 Kim CH,Khan M,Morin DE，et al.Optimization of the PCR for detection of Staphylococcus aureus nuc gene in bovine milk.J Dairy Sci,2001,84:74-83.

AnnewtemplatepreparationmethodforrapidandsensitivePCRdetectionofStaphylococcusaureusinfeces

FUSulan,LIUJingwu,SUNWenze.TheThirdHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo establish an new template preparation method for rapid and sensitive PCR detection of Staphylococcus aureus in feces.MethodsFTA filter membrane was used to extract DNA in Staphylococcus aureus from artificially contaminated feces.Primers targeting the thermostable nuclease gene (nuc) were used to amplify a 279 bp DNA fragment which was confirmed by DNA sequencing.ResultsApplication of FTA filter membrane could effectively extract DNA template and removed PCR inhibitive factor in specimens.In the detection of Staphylococcus aureus from artificially contaminated feces by PCR,the detection limit was 102cfu/ml,which could be finished within 6 hours.ConclusionPCR amplification using FTA filter membrane provides a faster and more sensitive method of detecting Staphylococcus aureus in feces.At the same time,which establishes a technological platform for rapid detection of foodborne pathogenic bacteria.

PCR；feces；Staphylococcus aureus；FTA filter membrane

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.09.005

050011 河北省石家庄市第三医院检验科

R 446.13

A

1002-7386(2014)09-1295-03

2013-10-30)