微生物传感器的发展及其在环境监测中的应用

付 强 林初文 陈 群

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州256600；2.北京尚洋东方环境科技股份有限公司，中国 北京100081）

0 引言

由于人们在追求经济效益的同时对环境保护的意识不够，环境污染变得突出，但传统的检测方法通常需要一定的分析技术，专业的实验室，人们需要找到一种简单，快速，便携的方法来检测各种有机和无机化学污染物，生物传感器可很好的解决这个问题。 根据生物传感器中所用分子识别元件上的敏感物质不同， 可以将生物传感器分为：酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、细胞传感器。其中酶传感器和微生物传感器研究得最多，应用也最为广泛。 本文主要介绍微生物传感器的发展及其在环境检测中的应用。

1 微生物传感器的发展过程

微生物传感器是指利用一定的固定化方法将生物敏感元件（对特定污染物有感应能力的微生物菌株）与具有信号转换功能的介质相连，并借助一定的设备将信号放大输出。 由于微生物传感器的核心部分是具有生物活性的微生物细胞，而微生物在其数量、大小、繁殖、遗传改造等方面均具有独特的优势，因此可以满足环境监测中快速简单、原位、低成本的要求。

1975 年Devis[1]制成了第一支微生物传感器。 在微生物传感器研制中最关键的是微生物的固定技术，固定后的微生物应尽可能保证细胞活性和避免细胞从膜中流失， 以延长微生物传感器的使用寿命，传统的生物材料固定方法包括物理吸附、共价键合、交联到一定的载体基质上或包埋于有机聚合物的基质中，然而这些方法都存在稳定期短和固定时引起微生物的损伤等缺陷。

纳米技术的出现提供另一种更好的固定方法，纳米管与聚合物复合材料用于电化学传感具有很多优点，如制备简单，易于制成同一厚度的膜等，可以有效地提高生物传感器的重现性。 导电聚合物(如聚吡咯、聚苯胺、聚嚷吩等)制成的导电聚合物膜具有良好的导电性，易于电子在生物活性物质与电极之间传递， 可用于制作第三代生物传感器。 10 年前已经出现的微生物燃料电池（(Microbial FuelCell，MFC)）技术正进入快速发展时期，这些进步均有助于促进了微生物传感技术的发展。

2 在环境监测中的应用

2.1 大气检测

SO2是酸雨酸雾形成的主要原因， 传统的检测方法很复杂。Sasaki（1997）将一种氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)制成微生物传感器，可以监测酸雨中的硫酸盐。王晓辉等[2]分别以氧化硫硫杆菌和多功能硫杆菌为分子识别元件，制备了硫化物和亚硫酸盐微生物电极，实验证明，电极的响应时间为3～6 分钟,以氧化硫硫杆菌为分子识别元件的电极选择性好， 它对S2-的线性范围为0.06～3.0mg/L，对SO32-的线性范围为0.7～32mg/L。 但对于此类传感器后续报道不多。 此外还有用于NO2检测的微生物传感器[3]。

2.2 水质监测

2.2.1 BOD 检测

生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand)简称BOD，是水体中微生物分解有机物的过程中消耗水中溶解氧的量，以mg/L 表示。BOD 的测定对控制水体污染具有更重要的意义， 传统测定BOD 的方法需要5 天，用传感器测定只需十几至几十分钟，胡磊等[4]采用接枝二茂铁为介体的微生物传感器测量污水的BOD。 结果表明，传感器的线性范围为2～300mg/L，连续测量20 个样品的精密度为4.2%，能连续工作35天。 通过对实际水样的测试表明，测得的BOD 与BOD5，具有良好的相关性。

虽然微生物电极法可缩短测定时间，但微生物固定化膜的制作工艺复杂且容易污染，同时单一菌种底物利用范围有限，在一定程度上限制了微生物电极的使用。 近年来，人们利用从污水和活性淤泥中富集的电化学活性微生物， 构建了多种有介体或无介体微生物燃料电池，同时发现电流（电压）或电子库仑量与电子供体的含量之间存在对应关系， 因此微生物燃料电池能用于某些底物含量的测定， 如废水BOD[5]以及有毒物质[6]等，其中用于废水中BOD 测定的研究最为成熟。

2.2.2 重金属检测

重金属污染广泛存在于环境中，它能通过生物富集作用对动植物及人类产生危害。利用分析化学方法检测重金属离子对其生物危害缺乏直接检定， 生物传感器检测重金属离子吸引了越来越多的研究兴趣。

发光微生物传感器是目前生物毒性测试中研究最多的微生物传感器之一。最常用的生物发光系统是用于水体毒性实验的Microtox 法评价。 早在1995 年国家环境保护总局就颁布了水质急性毒性的测定发光细菌法行业标准。李书钺[7]以明亮发光杆菌作为指示生物，研制的传感器将可同时分析Pb2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+、Cu2+对发光细菌的毒性作用，该传感器与传统实验方法具有较高的相关性。

Wang 等[8]采用嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)微生物传感器毒性分析系统，对Hg2+、Cu2+、Zn2+、Cr6+、Cd2+、Pb2+、Co2+等重金属和邻氯苯酚(2-CP)、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、邻硝基酚(2-NP)、对硝基酚(4-NP)、四环素、十二烷基苯磺酸钠(LAS)等有机物的生物急性毒性进行分析。 试验结果表明，基于对数生长后期和稳定期的嗜冷杆菌微生物传感器具有良好的毒性分析性能。Amaro 等[9]则以四膜虫（Tetrahymena thermophila MTT1、MTT5）金属硫蛋白激活子的真核生物荧光素蛋白基因作为信号载体，开发全细胞生物传感器，其检测重金属离子的灵敏性可与原核生物相当。

基因工程微生物在重金属离子检测方面也发挥了作用。Ravikumar 等[10]通过生物技术手段将对Zn2+、Cu2+敏感的两种启动子融合为双标记报告蛋白，开发出检测Zn2+、Cu2+的微生物传感器，最低检出浓度分别为16μM 和26μM。 Liu 等[11]从恶臭假单胞菌筛选出对Zn2+的特异性启动子czcR3 融合到增强型绿色荧光蛋白(egfp)，研制出用于特异性的检测Zn2+含量的生物传感器。Singh 等[12]固定小球藻于玻璃碳电极膜上研制微生物传感器监测Hg2+。 具有良好的响应时间、和持久性，电极响应的线性Hg2+浓度范围为10-14M～10-6M，可保持14 天使用期。

用死去的生物被动吸收重金属是一种更有效、经济、简单的方法。死细胞与活细胞相比，不需要营养，易于处理和储存，耐高毒性的反应环境。将铜绿假单胞菌烘干后构建微生物传感器检测重金属Pb2+，得出其对Pb2+的线性响应范围从1.0μM 到2.0μM，最低检测量为0.6μM[13]。

2.3 农药污染监测

我国是一个农业大国， 农药是农业生产中十分重要的生产资料，而有机磷农药(organophosphates, OPs)是目前应用范围最广，使用量最大的农药之一。 由于过度使用OPs 引发的环境问题日益严重，与此同时人们对于食品安全问题也日益关注。 OPs 可以与人体内的胆碱酯酶(cholinesterase, ChE)迅速结合，形成磷酰化胆碱酯酶，使酶失去活力，引发中毒、致畸等症状。 要预防和处理OPs 引起的环境和食品污染等问题，使用快速、高效、灵敏、准确的检测方法是十分重要的。

Tang 等[14]制备的微生物电化学传感器，可迅速检测对硫磷、对氧磷、甲基对硫磷浓度。 Anu Prathap 等[15]利用重组大肠杆菌制备测定有机氯农药（俗称林丹）的检测的微生物传感器，其测定的线性范围为2～45ppt，且具有高度特异性。 Liu 等[16]开发一种利用荧光假单胞菌检测苯酚和硝基酚的微生物传感器

2.4 其他监测

三氯乙烯（TCE）用作有机溶剂和工业脱脂剂，可引起中枢神经系统损害。TCE 可被恶臭假单胞菌产生的甲苯双加氧酶酶降解为为乙醛酸和甲酸离子，可用仪器检测。 基于这种反应机理开发的微生物传感器可检测出20μg L-1～150μg L-1含量的TCE[17]。

郭珺等[18]从沼气池中分离得到一株能以甲醇为唯一碳源和能源生长的菌株M211， 经鉴定为嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilium)，传感系统在0.02%～1% (V/V)甲醇含量范围内测定，响应时间小于20min，检出限为0.27mg/L，溶氧消耗量同甲醇含量呈线性关系，该测定体系不易受其它干扰物质影响，检测结果与实际样品浓度一致，该测定体系具有较强的选择性，及良好的重现性和稳定性，具有较好的应用前景。

甲醛含量已成为当今居室、食品、纺织品中污染监测的一项重要安全指标。 汤鸿雁等[19]以枯草芽孢杆菌为固定化菌株研制出甲醛微生物传感器，经测试，与乙酰丙酮分光光度法的测定结果有很好的一致性。

3 结语

相对于酶传感器，微生物传感器最大的优点就是成本低、操作简便、设备简单，所以应用市场潜力巨大，但它自身也存在了一定的的缺陷，比如反应时间比酶传感器要长，由于多酶体系的存在，有可能对复杂样品产生非特异性响应等。 有待我们进一步完善。 开发新的固定化技术，利用微生物育种、基因工程和细胞融合技术研制出新型、高效耐毒性的微生物传感器是该领域科研人员面临的课题。相信微生物传感器作为一个具有发展潜力的研究方向。定会随着生物技术、材料科学、微电子技术等的发展取得更大的进步，并逐步趋向微型化、集成化、智能化。 最后，检测不是目的，美好的环境需要人们共同呵护。

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