温胆汤对脂质代谢紊乱相关基因Adiponectin和LDLR甲基化的影响*

★ 杨海燕 王萍*

(江西中医药大学 江西 南昌 330006)

温胆汤是中医治疗痰证的名方，临床上用于治疗肥胖及相关疾病具有较好疗效[1]。以DNA甲基化为代表的表观遗传学机制参与了肥胖、心血管疾病、糖尿病、肿瘤等许多复杂疾病的形成和发展[2]。中医是否可以通过干预DNA甲基化状态达到调整机体的作用是很值得探讨的问题。脂联素(Adiponectin)和低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)均参与脂质代谢，与肥胖及相关疾病的形成有很大关联。本研究即探讨温胆汤对脂联素和低密度脂蛋白受体启动子甲基化状态的影响。

1 材料与方法

1.1 大鼠肥胖模型制作 选择SPF级SD雄性大鼠50只，体重(60±10)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2013-0004。大鼠随机分为两组，即高脂饲料喂养组(简称高脂组)和基础饲料喂养组(简称正常组)，其中高脂组30只，正常组20只。高脂组大鼠从购入起即进行高脂饲料喂养。高脂饲料由100g基础饲料中加入猪油15g、蛋黄粉10g、全脂奶粉15g、猪胆盐0.5及浓缩鱼肝油适量组成[3]。各组大鼠分别喂养4周后，淘汰体重过大或过小的大鼠，其中高脂组纳入20只，正常组纳入10只。高脂组入选大鼠的体重要符合肥胖模型的标准[4]。

1.2 药物干预 上述大鼠肥胖模型制作成功后，高脂组大鼠随机分为两组，每组10只，两组均停止高脂饲料喂养，采用基础饲料继续喂饲。其中一组高脂组大鼠用温胆汤灌胃干预1个月(温胆汤组)，另一组采用饮用水灌胃(模型对照组)。另有正常组10只，也采用饮用水灌胃(正常对照组)。温胆汤(陈皮10g、法半夏10g、茯苓10g、竹茹10g、炒枳实6g、炙甘草3g、生姜3g、大枣5g)各组成药物以中药配方颗粒剂进行配置，由广东一方制药有限公司生产。临用时把各颗粒剂放入容器中，加热水溶解，制成1g/mL生药浓度。温胆汤剂量采用人临床生药折算剂量5.5g/kg的2倍剂量11g/kg。

1.3 DNA提取 温胆汤干预1个月后，分别处死3组大鼠，获取肾周脂肪组织提取DNA。DNA提取采用高脂肪组织基因组DNA提取试剂盒(Solar-bti)，提取步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4 DNA甲基化特异性PCR检测 DNA进行纯度检测合格后，采用EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒进行亚硫酸氢钠修饰。然后进行PCR反应与琼脂糖电泳。DNA甲基化PCR引物设计采用urogene网站在线设计优化。

脂联素(Adiponectin)甲基化引物参数为：Left M primer，Start 1798，Size 25，Tm 59.11，GC% 56.00，'C's 5，Sequence TAAAGGTAGGATTTAGGTTTTGTGC；Right M primer，Start 2009，Size 24，Tm 58.61，GC% 54.17，'C's 4，Sequence CTTAAAAACCTCTCAACAAACTCG；Product size:212, Tm:68.9。

Left U primer，Start 1799, Size 25, Tm 59.00, GC% 60.00,'C's 5,Sequence AAAGGTAGGATTTAGGTTTTGTGTG；Right U primer，Start 2009，Size 25，Tm 57.74，GC% 56.00，'C's 4，Sequence CTTAAAAACCTCTCAACAAACTCAC；Product size:211, Tm:68.1。

低密度脂蛋白受体(LDLR)甲基化引物参数为：Left M primer，Start 660，Size 23，Tm 59.72，GC% 65.22，'C's 5，Sequence TTGTTAAGCGAGGGAGTTGTTAC；Right M primer，Start 849，Size 25，Tm 57.64，GC% 52.00，'C's7，Sequence ACCAAAATTCAATATCAAATATTCG； Product size:190,Tm:59.6。

Left U primer，Start 660，Size 25，Tm 58.27，GC% 64.00，'C's 5，Sequence TTGTTAAGTGAGGGAGTTGTTATGT；Right U primer，Start 847，Size 25，Tm 56.03， GC% 52.00，'C's 6，Sequence CAAAATTCAATATCAAATATTCACC；Product size:188,Tm:59.5。

1.5 统计学方法 计数资料采用IBM SPSS statistics 19统计软件进行卡方检验。

2 结果

2.1 DNA质量检测结果 样本的DNA纯度较好，可以满足甲基化PCR的要求。DNA纯度判断标准：OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染)。

2.2 脂联素启动子甲基化PCR结果 分别比较温胆汤组、模型对照组和正常对照组间肾周脂肪组织脂联素启动子的甲基化状态。结果显示，大鼠肾周脂肪脂联素基因存在着三种甲基化状态，即甲基化(M+,U-)、未甲基化(M-,U+)和不完全甲基化(M+,U+)。其中温胆汤组甲基化3例，非甲基化4例和不完全甲基化3例；模型对照组甲基化5例，非甲基化2例，不完全甲基化3例；正常对照组甲基化2例，非甲基化6例，不完全甲基化2例，见表1。若把甲基化和不完全甲基化同归为可能的甲基化状态，则温胆汤组甲基化状态为6例，模型对照组甲基化状态为8例，正常对照组甲基化状态为4例，见表2。采用卡方检验的fisher精确法检测结果显示，三组间均无统计学差异(P﹥0.05)。

表1 脂联素基因启动子甲基化结果

表2 三组间脂联素基因启动子甲基化的比较

2.3 大鼠LDLR启动子区经预测无CpG岛，考虑到人的LDLR启动子区有CpG岛，仍以urogene网站推荐基因甲基化PCR引物进行尝试研究，未能获得可信结果。

3 讨论

表观遗传学认为，基因启动子区的甲基化可能导致基因的表达受抑制[5]。本研究结果显示，高脂饮食导致的大鼠肥胖模型中，与代谢紊乱有关的基因(如脂联素)可能存在着启动子甲基化状态的改变。也就是说，高脂肥胖大鼠模型可能与调节代谢的基因表达改变有关。本研究结果即表明，脂联素在高脂模型中存在着启动子区甲基化的趋势，尽管从统计学上并无显著性差异，但这一趋势值得进一步探索。温胆汤作为中医治疗痰证的名方，对改善脂质代谢紊乱的肥胖具有较好的疗效。本研究发现，温胆汤可能可以逆转高脂饮食导致的脂联素基因启动子区甲基化的状态，这也可能是其发挥疗效的作用点。大鼠LDLR的启动子区虽然没有发现CpG岛，甲基化的可能性较小。但启动子区有时并不仅仅存在于转录基因之前的序列，也会存在转录序列之间。所以，高脂饮食导致的肥胖模型是否伴随着启动子区等序列的甲基化状态改变，还需要深入研究。更应该注意的是，人类的LDLR启动子区是存在着CpG岛的，这就需要在临床研究中去探讨此类问题。

现代研究发现，包括脂联素和低密度脂蛋白受体等在内的诸多基因的甲基化状态改变，与疾病的发生发展有着密切关联。如在一项针对动脉粥样硬化患者的研究中发现，AS患者存在着低密度脂蛋白受体的甲基化[6]。而肥胖对孕妇的脂联素基因的甲基化模式也有影响[7]。

中医的病证发生发展可能与表观遗传学等机制有关联[8]，而中医药干预疾病的机制多样，对表观遗传学机制的影响也可能是其中一环。但目前这方面的研究报道不多，是值得关注的领域。

[1]连东辉.加味温胆汤治疗痰湿壅盛型肥胖性高血压病60例[J].河南中医,2012,32(7):913-914.

[2]张林,胡茂清.表观遗传和肥胖[J].中国糖尿病杂志,2013,21(4):376-378.

[3]王磊,陈虹.幼年雄性SD大鼠营养性肥胖模型的建立[J].中国药业,2010,19(17):6-7.

[4]Chandler PC, Viana JB, Oswald KD, et al.Feeding response to melanocortin agonist predicts preference for and obesity from a high-fat diet[J].Physiol Behav，2005,85(2):221-230.

[5]史玉杰,李庆贺,刘晓辉.DNA甲基化与基因表达调控研究进展[J].中国生物工程杂志,2013,33(7):90-96.

[6]智艳芳,黄彦生,李著华,等.动脉粥样硬化病人LDL受体基因启动子序列的高甲基化改变[J].分子细胞生物学报,2007,40(6):419-427.

[7]Haghiac M, Basu S, Presley L，et al.Patterns of Adiponectin Expression in Term pregnancy: Impact of Obesity[J].J Clin Endocrinol Metab，2014, 99(9): 3 427-3 434.

[8]王萍,杨海燕,王丽萍,等.从表观遗传学开展复杂性疾病证候本质的研究[J].中华中医药杂志,2011,26(5):1 208-1 210.