基于四性角度探讨中药对DNA甲基化的干预作用*

★ 嵇琴 彭淑红 张敏 孙振 章明 朱卫丰*

(1.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 江西 南昌 330004；2.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心 江西 南昌 330004；3.江西中医药大学生命科学学院 江西 南昌 330004)

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，一般认为基因调控元件(如启动子)的CpG中发生5mC的修饰，会在空间阻碍转录因子复合物与DNA结合，因此，DNA甲基化一般与基因沉默相关联[1]。尽管有研究报道中药对DNA甲基化修饰有影响[2]，但是鲜有文献从中药四性角度阐述中药与DNA的甲基化的关系。中药四性是中药药性理论的重要组成部分，它是指寒热温凉四种药性，寒凉与温热是本质不同，互相对立的两种药性。凡能消除或减轻热性病证的药物，性属寒凉；凡能消除或减轻寒性病证的药物，性属温热。此外，中药药性理论认为还存在平性药物，是指寒热之性不甚明显，作用比较缓和的一类药物。因此，本文就从中药的寒凉、温热及平性的角度，综述不同药性对DNA甲基化修饰的影响，以探寻药性与DNA甲基化修饰之间的关系。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是最早被发现与基因抑制相关的表观遗传机制，它在维持正常细胞功能、胚胎发育、遗传印记、以及人类肿瘤发生中起着重要作用,是目前新的研究热点之一。它由DNA甲基转移酶(DNA-methyl transferase, DNMT)催化，利用 S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基供体，将胞嘧啶的第五位碳原子甲基化，从而使胞嘧啶转化为5甲基胞嘧啶(5mC)。哺乳动物中 DNMT 家族总共有5个成员，分别是DNMT3A、DNMT3B 、DNMT1、DNMT2和 DNMT3L，但只有 DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B这3种酶有甲基转移活性[3]。越来越多的研究表明中药可以通过干预DNA的甲基化修饰过程，而发挥其治疗的效果。

2 中药对DNA甲基化的影响

2.1 寒凉性中药对DNA甲基化的影响 一般来说，寒凉药具清热泻火、清热利尿、清化热痰、凉血解毒、滋阴除蒸、泻热通便、清心开窍、凉肝熄风等作用。实验发现四季三黄胶囊(主要由黄芩、黄柏、栀子、大黄等成分组成)可能通过提高动脉粥样硬化( As)小鼠血清DNA 甲基化水平和DNMTs 水平，从而起到降低血清甘油三酯( TG) 水平，稳定As 斑块的作用[4]。实验还发现蜂胶乙醇提取物(EEP)也能够提高或保持对小鼠心肌DNA甲基化水平，可能是因为EEP可以减轻自由基对于甲基化酶的破坏，从而保护DNA甲基化酶的结构，使DNA甲基化酶空间发生变构，使它更易于向甲基化位点转移甲基，从而提高了DNA甲基化效率，使细胞延缓衰老[5]。然而苦参碱[6]可以降低整体细胞DNA甲基化水平从而诱导白血病K562细胞凋亡。

绿茶中的茶多酚以及生物黄酮能抑制DNMT催化的DNA甲基化[7]。天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)也具有显著的去甲基化作用，TCS是葫芦科植物栝楼的块根内的有效成分，TCS通过降低DNMTs的活性，对脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)基因具有显著的去甲基化作用，从而抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖并诱导细胞凋亡[8]。

小白菊内酯 (Parthenolide) 是中药野生甘菊的主要提取成分，小白菊内酯含有α-亚甲基-γ-内酯环和环氧化物结构[9]，小白菊内酯的γ-亚甲基内酯环通过烷基化反应中的Cys1226巯基的催化结构域硫醇盐抑制 DNMT1；使 G1期细胞静息或干扰转录因子Sp1与DNMT1启动区结合，下调DNMT1表达[10]。

雷公藤甲素(triptolide，TP)又称雷公藤内酯醇(triptolide，TL)，是从雷公藤根中分离出的二萜类化合物[11]。HL对细胞周期起负调控作用，主要是通过逆转人恶性淋巴瘤CA46细胞异常甲基化的p16基因去甲基化[12]。HL可抑制人髓系白血病细胞系HL-60细胞增殖，诱导细胞凋亡，且不同浓度的TL抑制作用呈现时间-剂量依耐性，可能是通过下调甲基转移酶基因DNMT1/3B mRNA的表达，降低LINE-1、DAPK-1基因甲基化程度，使DAPK-1基因表达上调实现的[13]。TP 也可明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表达，抑制P53特别是 P73基因启动子区甲基化，促进P53、P73的表达，并且能够抑制MCF-7细胞的增殖[14]，TP可通过抑制甲基转移酶使P53基因去甲基化,促进P53蛋白的表达,从而抑制SMMC-7721细胞的增殖[15]，TP还可以逆转Jurkat细胞apc基因甲基化[16]。 18nM TL处理HT-1080细胞72小时后TL通过上调DNMT-1和一3A的表达，进而上调基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的甲基化水平，最终抑制人纤维肉瘤HT-1080细胞的MMP-9基因的表达及活性[17]。

2.2 温热性中药对DNA甲基化的影响 温热药一般具温里散寒、温阳利水、温经通络、补火助阳、暖肝散结、引火归原、回阳救逆等作用。姜黄素(curcumin)是从我国传统中药姜黄根茎中提取的一种植物多酚,它为一种强力的DNA甲基化抑制剂，通过与DNMT1的分子间的相互作用，抑制DNMT1的活性，从而使基因组整体的甲基化下降而发挥作用[18]。中浓度40umol/L与高浓度60umol/L姜黄素处理后的SGC-7901细胞、HeLa细胞、HepGZ细胞的p16基因和MGMT基因的启动子区CpG岛甲基化程度下降，表明姜黄素对肿瘤细胞P16基因和MGMT基因有一定的去甲基化作用[19]。姜黄素也可能上调鼻咽癌细胞回复引导半胱氨酸丰富蛋白含kazal基元( RECK) 基因表达，降低RECK甲基化水平，从而抑制 MMP-9 的表达与活性而发挥对 CNE-1 细胞生长抑制作用[20]。

参茸补血丸(由人参、鹿茸、杜仲、巴戟天等药组成)能促进去势大鼠生殖器官的发育，明显降低肝、肾组织 DNA 甲基化酶活力和DNA甲基化水平，提高对应组织中 RNA 聚合酶活力，能使受损机体肝、肾组织低甲基化，基因高表达以代偿因切除卵巢带来整体效应低下[21]。

用补肾益精法软皮汤方(熟地黄、阿胶、山茱萸、黄芪、山药、红花、茯苓等组成)含药血清干预硬皮病成纤维细胞，可减少DNMT1 的表达[22]。丹参提取物丹参酮ⅡA也可明显降低DNMT1基因的表达，且对肝癌HepG2细胞具有显著的抑制作用[23]。

2.3 平性中药对DNA甲基化的影响 树舌多糖(gapsgf, GF)为树舌的主要有效成分，应用限制性酶切片段长度多态性(RFLP)法观察GF对小鼠HepA瘤基因组甲基化的影响,发现GF能明显提高小鼠HepA瘤基因组甲基化的发生率，具体的分子机制尚不清楚，推测可能具有逆转突变的5mC(T)的作用，可能是通过抑制癌基因的低甲基化或恢复基因的功能而实现的，也可能是通过使腺昔基蛋氨酸合成酶基因表达增高、和或使甲基化酶活性增高的作用而实现的。另外树舌多糖具有明显的抗肿瘤作用，且有诱导细胞凋亡的作用，能够阻滞细胞周期，使S期细胞不能进入GZ-M期，阻滞于S期[24]。

2.4 药性不明中药对DNA甲基化的影响

2.4.1 抗衰老药物衰老过程中DNA 甲基化水平呈下降趋势，DNA甲基化酶活力随大鼠年龄增加而明显降低，DNA 甲基化酶活性随衰老而下降[25]。小鼠脑、肝细胞DNA甲基化酶活力也随着老鼠年龄的增高而下降，益肾健脾方剂能显著提高生理性肾虚小鼠肝细胞甲基化酶的活力，用8.4%的益肾方和15.2%的健脾方喂养成年小鼠和老年(生理性肾虚组)小鼠8周后发现，给药各组的小鼠肝、脑细胞DNA甲基化酶活力均明显增高，其中对脑的作用益肾方(成年组增高30%，老年组增高18%)比健脾方(成年组增高21%;老年组增高13%)强；而对肝的作用健脾方(成年组增高61%，老年组增高63%)则明显强于益肾方(成年组增高36%，老年组增高35%)[26]。除此之外，小鼠服用一定浓度的茶多酚后，有可能通过改变DNA甲基化酶的空间构象，使其更容易向正常甲基化位点转移甲基，达到提高DNA 甲基化酶活性的目的，从而发挥抗衰老的作用[27,28]。神方补肾生血药(主要由生地、山萸肉、龟版胶、阿胶、枸杞等十余味中药组成)同样能明显提高老龄大鼠肝组织DNA甲基化酶活力和DNA甲基化水平，达到延缓衰老的作用[29,30],也可显著提高老龄大鼠脑组织中DNA甲基化酶的活性，从而提高DNA甲基化酶的热稳定性，还可提高大鼠脑DNA甲基化酶对NaCl的耐受性[31]。

2.4.2 治疗肾病药物中医认为，肾病是由外邪侵袭，或劳欲过度，久病耗伤精气等所致。肾病是一个很笼统的概念，简单地说，只要肾脏有病，统统叫肾病。从糖尿病肾病大鼠的胰腺组织中提取基因组DNA，采用甲基化敏感性限制性核酸内切酶HpaII和MspI(为一组同裂酶)进行限制性酶切，并进行染色质DNaseI敏感性分析，发现糖维康(太子参、玄参、黄芪、僵蚕、丹参、水蛭等)治疗糖尿病肾病后能向正常方向逆转胰腺组织DNA 中CCGG位点甲基化状态，通过提高基因转录水平和向正常方向恢复甲基化状态而发挥治疗糖尿病的作用[32]。慢性肾功能衰竭患者血清同型半胱氨酸水平升高发生率高达82.5%，其水平为正常人的2～3倍，尿毒清颗粒(大黄、黄芪、桑白皮、苦参、白术)可以使慢性肾功能衰竭大鼠基因组DNA从低甲基化状态恢复到正常水平[33]，达到恢复慢性肾功能衰竭大鼠肾功能的作用。补肾中药二至天癸颗粒(由女贞子、旱莲草、枸杞子、菟丝子等组成)在一定程度上也可以纠正Snrpn和Peg1/Mest基因的异常去甲基化，改善肾虚小鼠受精卵卵裂率、囊胚形成率，发挥治疗不孕症的作用[34]。

2.4.3 治疗狼疮药物 三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是中药砒霜的主要成分，它对MRL/lpr狼疮鼠有一定的治疗作用，作用机制有可能是通过升高狼疮鼠脾脏单个核细胞DNMT1基因表达水平，从而达到改善狼疮的DNA低甲基化状态的目的[35]。砷剂也能引起 p53 和 p16 基因启动子的高甲基化，并且甲基化程度与砷的剂量呈正相关[36]，ATO 处理的 MRL/lpr小鼠 CD4+T 细胞平均甲基化水平与空白对照组相比有明显的上升[37]。我国更有许多实验证明：ATO 能提高 MRL/lpr狼疮小鼠的脾脏与淋巴结 DNA 整体甲基化水平[38]，从而下调 IFN-γ和 IL-4 的表达。有研究采用体外试验给予 ATO 0.4 mg/(kg d) 隔日腹腔注射，证实 ATO 可改善 MRL/lpr自发性狼疮小鼠脾脏单个核细胞的低甲基化状态；体内试验1 μmol/L ATO 作用 24 h 能在一定程度上有效逆转活化状态下 MRL/lpr狼疮小鼠脾脏 CD4+T 细胞 IFN-γ基因启动子低甲基化[39]，基于此认为 ATO 可能通过逆转 SLE 的低甲基化状态，从而治疗SLE。

2.4.4 治疗胃癌药物 胃癌居我国恶性肿瘤死亡率首位[40], 严重威胁人类健康。解毒化瘀健脾方对异型增生胃黏膜细胞p16 、PTEN 基因具有一定的去甲基化作用，同时诱导p16、PTEN蛋白的高表达,对胃黏膜异型增生具有潜在的治疗作用[41]。白藜芦醇在浓度(0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)以剂量依赖性方式抑制人胃癌SGC-7901 细胞增殖，且随着浓度的增加，RASSF1A甲基化的水平逐渐减弱，非甲基化水平逐渐增多。同时RASSF1A的mRNA 和蛋白表达水平明显上调[42]，白藜芦醇也能够显著改变糖尿病大鼠主动脉的细胞因子基因的甲基化状态[43]。以N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG )为主的多因素联合攻击法诱发的胃癌前病变大鼠检测出抑癌基因 E-cadherin、p16 发生高甲基化及基因c-myc发生低甲基化，胃宁颗粒(主要成分为黄芪、白花蛇舌草、莪术、枸杞等)对E-cadherin 基因甲基化无相关作用; 对 p16、c-myc基因甲基化发生相关调控作用[44]。消痰散结方(有半夏、胆南星、茯苓、枳实、陈皮、炙甘草等组成)能降低胃癌P16基因启动子区域甲基化水平，增加P16基因mRNA的表达,从而有效抑制胃癌细胞系以及裸鼠原位移植瘤的生长[45]。

2.4.5 治疗乳腺癌药物乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在妇女仅次于子宫癌，已成为威胁妇女健康的主要病因，二氢杨梅素显著诱导乳腺癌细胞 PTEN 基因去甲基化，促进其表达，其机制可能主要涉及对 DNMT1 表达和活性的抑制[46]。紫杉醇[47]可以降低整体细胞DNA甲基化水平从而诱导乳腺癌细胞凋亡。

2.4.6 治疗骨髓增生异常综合征药物青黄散(由青黛、雄黄组成)通过抑制DNMTl mRNA的表达使S-腺苷甲硫氨酸(SAM)向S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的进一步代谢减弱，结果使SAM向DNA提供的甲基基团减少，降低了DNA的甲基化，从而改变骨髓增生异常综合征(MDS)患者高甲基化状态起到治疗骨髓增生异常综合征(MDS)作用[48]。

2.4.7 其它 口服蜂王浆对雄性大、小鼠脑、肝、肾及血液DNA甲基化水平没有影响[49]。血府逐瘀胶囊(主要由桃仁、红花、赤芍、川芎等成分组成)可提高动脉粥样硬化( As)小鼠血清DNA 甲基化水平和DNMTs 水平，从而起到降低血清甘油三酯( TG) 水平，稳定As 斑块的作用[4]。槲皮素可以通过降低RASSF1A、p16INK4a和Erb基因启动子区的甲基化水平，从而阻滞细胞周期停留在G0/G1期[50]。愈肝颗粒(由茵陈、党参、栀子等13味中药组成)通过降低DNMT1、DNMT3A和DNMT3B表达水平，从而调整DNA的甲基化状态同样可以起到防治肝癌发生的作用[51]。

表1 四性中药与DNA甲基化相关研究结果一览表

3 小结与展望

中药四性是中药药性的核心，客观准确的判别中药的四性是中药药性研究的难点和热点。随着近年来人们对DNA甲基化的研究深入和对中药干预甲基化实验的逐步展开，该课题组对DNA甲基化修饰与中药药性之间是否有某种联系产生了很大的兴趣。因此，文章通过综述中药对DNA甲基化的研究报道，将其归纳总结为表1。通过文献整理，可以看出：(1)目前报道的寒凉药对DNA全基因组甲基化的作用有升高也有降低；(2)目前报道的温热药均显示出能降低DNA甲基化酶活力或DNA甲基化水平的作用；(3)平性药干预DNA甲基化水平的报道并不多；(4)对于DNA甲基化干预作用中药，大多药性不明，不便归类。

鉴于目前对于已确定药性的中药作用于DNA甲基化的研究并不太多，以及寒热或温凉作用的靶点不一，即使同一药性的中药作用靶点也不一样，因此找出DNA甲基化与中药药性之间的确切关系仍面临种种困难。另外，目前中药干预DNA甲基化的研究均是个别中药，尚无针对寒热或温凉药物与DNA甲基化修饰的系统研究，所以也增加了对药性规律统计的难度。相信随着中药干预DNA甲基化研究的不断深入和扩展，中药干预DNA甲基化的具体靶点和机制的逐渐明确，以及未来对中药四性与DNA甲基化系统性研究的力度加大将极大促进中药药性的本质阐释和客观化判别进程。

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