肝主疏泄对模型动物胆固醇浓度的影响*

★ 倪祥惠 赵博 曹峰 秦钟 吴大梅 黄聪 吴筱枫 吴菁

(贵阳中医学院 贵州 贵阳 550002)

中医学认为胆汁是肝之余气所化生，肝的主要生理功能是主疏泄。肝的疏泄状态在一定程度上影响着胆汁的分泌与排泄，肝疏泄功能正常则胆汁分泌、排泄正常，反之则失常。其次，肝的疏泄功能与情志之间也有着密切的关系，疏泄太过则烦躁易怒，不及则情志抑郁；反之，情志变化也会影响到肝的疏泄功能。

胆固醇作为胆汁中的主要成分之一，与各种胆病的形成有着密切关系，因此通过观察肝失疏泄状态下模型动物胆汁中胆固醇浓度的变化规律，能够在一定程度上为“胆病从肝论治”提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物与分组 6周龄SPF级雄性SD大鼠24只，体质量170～190g，购于解放军第三军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)2012-0003。适应性喂养1周后，将其分为正常组、CUMS(慢性不可预知性应激)组和单纯束缚组。

1.2 实验试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 胆固醇ELISA检测试剂盒，购于昆明腾科科技有限公司。

1.2.2 实验仪器 止血钳，手术刀，胆汁引流管，眼科剪，恒温水浴箱，-20℃冰箱，-80℃冰箱，离心机，酶标仪。

2 方法

2.1 模型的制备 将24只大鼠随机分为正常组、CUMS组和单纯束缚组，每组8只。

2.1.1 CUMS模型的复制 每只模型组大鼠均进行单笼孤养。CUMS模型的制备方法：在金光亮等人[1]提出的造模方法基础上根据自身实际情况进行操作，将7种刺激(①4℃冷水游泳5min；②45℃热刺激5min;③12h禁水；④24h禁食；⑤12h昼夜颠倒；⑥行为限制；⑦45min无规则水平摇晃)随机安排到21天内，每天2种，保证相邻两天不重复同一种刺激。本组动物造模过程中1只大鼠意外死亡。

2.1.2 单纯束缚模型 参考唐已婷等人[2]文献中提到的造模方法,使用鼠笼加报纸填塞法限制大鼠活动(3h/d)。

2.3 取材方法 造模21天后取材。用10%水合氯醛按照0.3mL/100g进行腹腔麻醉，将麻醉好的大鼠置于鼠板固定，沿腹正中线切开，找出十二指肠，沿十二指肠找到胆管，分离胆管后在胆管远端用眼科剪剪一个小口，将胆汁引流管沿小口插入将胆汁引出。计算流出时间，收集半小时内流出的胆汁，将其放入冻存管中，于-80℃超低温冰箱中保存待测。

2.4 指标检测 采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验法(ELISA)定量检测胆汁中胆固醇含量。

2.4.1 ELISA法检测胆汁中胆固醇含量 ①将试剂盒平衡至室温，取出所需反应板，分别设置空白孔(不加样品和酶标试剂，其余各步骤操作相同)、标准孔、待测样品孔。②标准孔加入50μL标准品，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育30min。③甩尽板内液体，将事先用蒸馏水配置好的1∶30(浓缩洗液：蒸馏水)洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μL洗涤液)，静置30s甩尽板内液体，并去除孔内水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次。④每孔加入50μL酶标试剂(空白孔除外)，轻轻混匀10s，37℃温育30min；⑤再用1∶30洗涤液洗涤反应板，静置30s甩尽板内液体，并去除孔内水滴；反复洗涤5次。⑥每孔先加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻混匀30s，37℃避光显色10min。⑦每孔加入终止液50μL，15min内在450nm处读OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3 数据处理

4 结果

CUMS组和单纯束缚组胆汁中胆固醇的含量均较正常组胆汁中胆固醇的含量增高,CUMS组与正常组之间存在着显著性差异(P<0.05)，但是,单纯束缚组与正常组之间没有显著性差异。模型动物胆固醇含量OD值详见表1。

表1 胆固醇含量OD值±s)

5 讨论

《灵枢·本输》曰：“肝合胆，胆者，中精之府。”《东宝医鉴》指出：“肝之余气，溢入于胆，聚而成精。”中医学认为，胆汁是“肝之余气”积聚而成。中医学藏象理论认为，肝具有主疏泄的生理功能，肝与胆相表里，因此肝的疏泄功能在一定程度上与胆汁的分泌和排泄密切相关；同时肝的疏泄功能也是维持脾胃正常消化功能的重要组成部分。肝疏泄功能正常则胆汁分泌、排泄正常，反之则失常，易造成胆汁的分泌与排泄功能失常，胆汁郁结；肝胆的气机不利就容易导致多种相关疾病的产生。

CUMS造模法和单纯束缚造模法是目前常用的影响肝疏泄功能的造模方法。CUMS造模法通过中慢性、低水平、不可预知的应激刺激，较好地模拟了现代社会快节奏生活下竞争激烈、压力加重等所导致的抑郁症，是经典的抑郁症动物模型。而抑郁症正是肝主疏泄功能失常的表现。单纯束缚造模法也是较为成熟的动物肝郁造模法，广泛用于抑郁症以及逍遥散干预作用等实验研究中，也是可以影响肝的疏泄功能的造模法。故本课题选用CUMS造模法和单纯束缚造模法研究在肝失疏泄情况下模型动物胆汁中胆固醇含量的变化，以期明确肝主疏泄功能失常对模型动物胆固醇浓度有无影响。

胆固醇作为一种环戊烷多氢菲的衍生物，广泛存在于动物体内，在脑以及神经组织中含量最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中的含量也较高。现代科学研究显示，多种胆病的形成与胆汁中胆固醇含量密切相关。我国胆囊结石的发病率已占胆石病的主要地位，且以胆固醇结石为主。目前临床上治疗胆石类疾病可以选择“胆病从肝论治”，这一治疗法则有无科学意义也需要我们进一步明确。

本研究结果显示，CUMS组和单纯束缚组模型动物胆汁中胆固醇含量均较正常组增高，并且CUMS组模型动物胆汁中胆固醇含量与正常组相比较有统计学意义(P<0.05)，单纯束缚组与正常组比较其差异没有统计学意义，CUMS组和单纯束缚组之间比较其差异也没有统计学意义。这就在一定程度上说明了肝的疏泄功能失常会影响到胆汁中胆固醇的含量，并使其含量增高。我们知道胆固醇是绝大多数胆结石的主要成分，胆汁中胆固醇的过度饱和是胆固醇结石形成的必要条件。因此我们可以推测，肝的疏泄功能失常造成的胆固醇浓度升高有可能是胆固醇性胆结石形成的原因之一，也为治疗胆石类疾病选择“胆病从肝论治”提供一定的实验支持；但是，肝的疏泄功能失常造成的胆固醇浓度升高的具体发生机制，还有待于进一步深入研究。

[1]金光亮,南睿,郭霞珍.慢性应激肝郁大鼠模型的建立[J].北京中医药大学学报,2003,26(2):18-21.

[2]唐已婷,陈家旭.束缚应激与中医肝的关系[J].中国医药学报,2002,17(2):82-83.