HPLC法测定龙掌口含液中异阿魏酸含量

★ 戎其月 刘凯 李丹 魏茂陈

(1.扬州市中医院药剂科 江苏 扬州 225009； 2.贵阳新天药业股份有限公司 贵州 贵阳 550010)

龙掌口含液主要是由飞龙掌血根皮、飞龙掌血叶、地骨皮、升麻四味药材组成，用于治疗口臭、复发性口疮(口腔溃疡)、牙龈炎、牙周炎。方中升麻的主要功效为发表透疹，清热解毒，升举阳气。用于风热头痛，齿痛，口疮，咽喉肿痛，麻疹不透，阳毒发斑，脱肛，子宫脱垂[1]。升麻中的阿魏酸和异阿魏酸等咖啡酸衍生物具有较强的抗炎活性，一般认为有机酸是升麻清热解毒的有效成分，其含量检测方法有TLC法、HPLC法[2]。质量标准制定时拟将其列入含量测定项下对其进行控制，现建立测定龙掌口含液方中的异阿魏酸含量的HPLC法，该方法准确、精密度、重复性好。

1 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪；电子天平(十万分之一)AE240型(Mettler公司)；异阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111698-200501)，龙掌口含液样品(贵阳新天药业股份有限公司提供，批号：070701)及阴性样品均由贵阳新天药业股份有限公司提供；乙腈为色谱级；水为重蒸馏水；乙醇、磷酸为分析纯。

2 方法

2.1 液相色谱分析条件 液相色谱柱为伊利特ODS2 C18柱(250mm×4.6mm,5μm )，流动相为乙腈-0.1%磷酸(13∶87)为流动相，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为316nm，理论板数按异阿魏酸峰算应不低于5000，色谱数据处理系统为化学工作站。

2.2 供试品溶液的制备 精密量取本品5mL，置25mL量瓶中，加10%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取异阿魏酸对照品适量，置50mL棕色量瓶中，加10%乙醇溶液，溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液，取配好的对照品储备液依次稀释成依次稀释成4.4，11，22，33，44μg/mL 5份不同浓度对照品溶液，即得。

3 结果

3.1 专属性实验 取不含升麻药材的龙掌口含液药液，按供试品溶液制备方法制成阴性样品后，将适量的缺少升麻的阴性样品溶液、对照品溶液、供试品溶液，放入高效液相色谱仪中，取样量设置为10μL。供试品溶液图谱与对照品溶液图谱相同处有相同色谱峰，色谱峰分离度良好，基线稳定，整个分析在30min时间内完成，阴性样品无干扰。见图1。

3.2 线性关系考察 取配制好的五份不同浓度的对照品溶液进样量10μL，测定。以浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标进行一元线性回归，回归方程为Y=45.92X-7.2748，r=1，拟合过原点的直线方程为：Y=45.691X，r=1，,结果表明异阿魏酸在4.4～44μg/mL范围内线性关系良好。

A.对照品；B.供试品；C.阴性样品

3.3 精密度试验 取异阿魏酸对照品溶液(22μg/mL)10μL，注入液相色谱仪，连续进样5次，每次进样10μL，以异阿魏酸峰面积为指标，结果RSD为0.2%，表明本法精密度良好。

3.4 重复性试验 取龙掌口含液(批号：070701)样品，按2.2平行制备供试品6份，按2.1液相色谱分析条件，依次进样量10μL，测定异阿魏酸的含量，结果RSD为1.2%，表明本法重复性良好。

3.5 加样回收率试验 分别取六份已知含量的龙掌口含液(批号：070701)5mL，置50mL量瓶中，精密加入上述异阿魏酸对照品溶液(0.249mg/mL)3mL。按2.2项下制备方法平行制备供试品，按2.1液相色谱分析条件进样10μL，测定异阿魏酸的含量，测定结果平均回收率为100.1%，RSD%为1.0%。见表1。

3.6 稳定性试验 取龙掌口含液(批号：070701)按2.2制备供试品溶液。按2.1液相色谱分析条件，进样量10μL，在0，1，2，4，8，12，24 h测定异阿魏酸的峰面积，计算含量，结果RSD为0.2%，结果显示样品在24h内稳定性良好。

3.7 样品含量测定 取3批样品，每批2份，按2.2项下制备方法制备供试品溶液，按2.1液相色谱分析条件测定异阿魏酸的含量，结果见表2。

表1 异阿魏酸加样回收率试验结果表(n=6)

表2 3批样品含量测定结果表(n=2, mg/100mL)

4 讨论

升麻中含有异阿魏酸、阿魏酸及其他三萜化合物、香豆素等成分[3]。异阿魏酸具有抗炎、镇痛等作用[4]，为本品主要成分之一，2010年版《中国药典》一部中规定的升麻定性鉴别及含量测定均以阿魏酸、异阿魏酸作为指标成分。据文献报道对所收集的不同产地16批升麻样品同时测定其中阿魏酸和异阿魏酸，发现两种成分的量相差悬殊，异阿魏酸约为阿魏酸的10倍[5]。故本实验以异阿魏酸的含量测定为检测指标较为客观合理。

据文献报道，异阿魏酸对照品溶液不稳定，见光易水解，对照品曝光室温放置数日后含量降低明显，所以本实验在配异阿魏酸对照品溶液时使用棕色容量瓶，在冰箱中(4℃)保存，避光处理24h内很稳定。在提取溶剂的选择上，分别考察了10%乙醇溶剂、乙酸乙酯萃取后加乙醇溶解、乙醇、水，结果10%乙醇和水对异阿魏酸的提取较完全，且易于操作，因此，综合考虑将10%乙醇对供试品进行提取。

[1]国家药典委员会.中国药典·一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：68-69.

[1]GAO Jin-ming,ZHANG An-ling,ZHANG Kang-jian,et al. Advances in the researches of distribution, extraction and bioactivities of chromogenic acids[J].J Northwest Forest Univ,1999,14(2):73.

[1]Xiao P G.Modern Chinese Material Medical[M].Beijing: Chemical Industry Press,2002:785.

[1]Yin J.Modern Studies and Clinical Applications in Traditional Chinese Medicine[M].Beijing:Publishing House of Ancient Chinese Medical Books,1995:260.

[1]刘颖，张小茜.升麻质量标准的研究[J].中草药，2005:36(9):1 402-1 403.