Box-Behnken效应面法优化金银花中绿原酸提取工艺

★ 谭梅英 詹利之

(1.广东省第二中医院药学部 广东 广州 510095；2.广州中医药大学青蒿研究中心 广东 广州 510095)

金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花。夏初花开放前采收，干燥。具有清热解毒，疏散风热的功效。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热等症[1]。金银花具有广谱的抑菌活性，并且对消化系统、血液系统和生殖系统均有一定的药理作用。绿原酸为金银花抗菌作用的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压及兴奋中枢神经系统等多种药理作用[2-8]。

本文采用Box-Behnken效应面法优化金银花中绿原酸的提取工艺[6-8]，将多个因素与指标的交互关系以二次多项式拟合，并对等高线进行分析，研究各个自变量之间以及与因变量之间的函数关系，得到拟合度优良的回归方程，从而实现对金银花提取工艺的优化。

1 仪器与试药

安捷伦1100型高效液相色谱仪(美国)，四元梯度泵，配有DAD检测器；双杰JJ-BC系列电子分析天平(美国)。

金银花(购于广州致信药业有限公司，批号130112)，经鉴定为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花；绿原酸对照品(购于中国食品药品检定研究院，批号110753-201314)；高效液相色谱用乙腈为色谱纯，高效液相色谱用水为双蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 金银花中绿原酸的含量测定

2.1.1 绿原酸含量测定色谱条件 所使用的色谱柱为安捷伦公司出品的Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)柱；实验所采用的流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87)(V/V)；流速：1.0mL/min；进样体积：10μL；柱温：25℃；检测波长：327nm。

2.1.2 绿原酸对照品溶液的制备 取于中国食品药品检定研究院购买的绿原酸对照品(批号110753-201314)适量，精密称定，置于棕色容量瓶中，加入50%甲醇制成每1mL含60.12μg的绿原酸对照品溶液，在10℃以下保存，备用。

2.1.3 金银花供试品溶液的制备 精密吸取金银花提取液(表1试验设计所得)1.0mL，置50mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性范围的考察 精密量取“2.1.2”项下配制好的对照品溶液1，2，4，6，8，10mL，分别置10mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，制得绿原酸浓度为6.012，12.024，24.048，36.072，48.096，60.120μg/mL的溶液。精密吸取上述一系列绿原酸对照品溶液各10μL，注入安捷伦高效液相液相色谱仪中，依法测定。得到线性回归方程Y=2638.6418X+3.6268，r=0.99993，其中自变量(X)为进样量(μg)，因变量(Y)为峰面积。结果表明，绿原酸在0.06012～0.60120μg范围内，其进样量(μg)与峰面积呈现出良好的线性关系。

2.1.5 绿原酸含量测定精密度试验 精密吸取同一对照品溶液(24.048μg/mL)10μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，记录色谱图。计算绿原酸峰面积值RSD=0.32%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 绿原酸含量测定稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(6号)10μL，分别于0，1，2，4，8，12h进样测定。计算绿原酸峰面积值RSD=0.73%。表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.1.7 绿原酸含量测定重复性试验 精密吸取同一提取液样品(6号)6份，按上述的方法制备供试品溶液，依法测定，记录色谱峰面积，计算供试品中绿原酸的含量。结果绿原酸的平均含量为1.56%，RSD=1.19%。结果表明，此方法的重现性良好。

2.1.8 绿原酸含量测定加样回收率试验 精密吸取已知含量的提取液样品(6号，绿原酸1.56%)6份，每份0.5mL，分别精密加入绿原酸对照品溶液(21.120μg/mL)0.5mL，按上述的方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。结果绿原酸平均回收率为98.13%，RSD为1.91%(n=6)。表明所建立的绿原酸含量测定方法具有良好的回收率。

2.2 Box-Behnken效应面法优化金银花中绿原酸的提取工艺

2.2.1 绿原酸提取工艺试验设计方案 本实验采用Design-Expert7.0.0软件进行试验设计，综合单因素考察的实验结果，提取温度固定为100℃，提取次数固定为2次。选择乙醇浓度、溶剂体积和提取时间3个考察因素，进行编码，以绿原酸的提取率为因变量(Y)，实验设计和结果见表1。

表1 绿原酸提取工艺Box-Behnken设计方案与实验结果

2.2.2 模型的建立及显著性检验 采用方差分析效应面的回归参数。由表2可知，乙醇浓度一次项、溶剂体积二次项与提取时间二次项达到极显著水平(P<0.01)，乙醇浓度二次项、溶剂体积一次项与提取时间一次项达到显著水平(P<0.05)。经过多元回归拟合，得到绿原酸提取率对乙醇浓度(A)、溶剂体积(B)和提取时间(C)的二次多项回归模型：

Y=0.025417+0.014937A+0.070500B+0.014764C+1.50000×104AB-4.16667×106AC-3.33333×105BC-1.13542×104A2-2.31667×103B2-8.37963×105C2

式中，Y-绿原酸提取率(%)；A、B、C-分别代表乙醇浓度(X1、X2、X3)、溶剂体积(X1、X2、X3)、提取时间(X1、X2、X3)。结果表明，所建立的回归方程对试验拟合较好。

表2 二次回归方程方差分析

2.2.3 绿原酸提取工艺的响应面分析与优化 采用软件，作出相应的曲面图和等高线图，如图1～6所示。结果表明，绿原酸的提取率随着乙醇浓度和提取时间的增加呈线性增加；溶剂体积对绿原酸提取率的影响近似呈二次关系，当乙醇浓度在75%左右，溶剂体积在17倍左右，提取时间在82min左右，绿原酸提取率达到最大值。

图1 乙醇浓度与溶剂体积对绿原酸提取率影响等高线图

图2 乙醇浓度与溶剂体积对绿原酸提取率影响3D响应面图

图3 乙醇浓度与提取时间对绿原酸提取率影响等高线图

图4 乙醇浓度与提取时间对绿原酸提取率影响3D响应面图

图5 提取时间与溶剂体积对绿原酸提取率影响等高线图

图6 提取时间与溶剂体积对绿原酸提取率影响3D响应面图

2.2.4 金银花中绿原酸最佳提取工艺条件 结合二次回归模型的数学分析结果，金银花中绿原酸的最佳提取工艺参数：乙醇浓度为75.53%，溶剂体积为17.06倍，提取时间为82.83min。绿原酸理论提取率为1.8025%。考虑到实际生产情况，将各因素条件取整确定最佳提取工艺条件为：17倍量76%乙醇提取83min。对最佳工艺条件进行验证实验，结果表明，绿原酸提取率为：1.8245%，1.7868%，1.7954%，1.7805%，1.7801%，平均提取率为1.7935%，RSD为1.03%(n=5)，说明该模型可靠。

3 讨论

Box-Behnken 效应面法是近年来国内外药学工作者常用的试验设计方法，适用于多因素多水平试验设计。它采用数学建模的方法，拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析以寻求最优工艺参数，从而解决正交设计和均匀设计无法精确得到最佳点，以及不能灵敏地考察各因素的交互作用等缺点。与中心复合设计法相比，Box-Behnken 效应面法具有试验次数少的特点，从而节约实验成本。

本文以绿原酸提取率为量化指标，在预试验的基础上采用Box-Behnken效应面法对金银花提取工艺进行优化，最终确定其最佳提取条件。在最佳条件下，实测值与预测值比较吻合，相对偏差较小。表明Box-Behnken效应面法在金银花提取工艺应用中的可行性。本研究为中药提取工艺的优化提供实验参考。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：205.

[2]王清，朱萱萱，张赤兵，等. 金银花提取物抗菌作用的实验研究[J].中国医药导刊，2008，10(9)：1 425-1 430.

[3]吴江涛. 绿原酸的生物活性及其应用[J].现代农业科技，2009，(19)：349-350.

[4]尉芹，马希汉. 绿原酸及其提取分离方法评述[J].中成药，2001，23(2)：136.

[5]王辉，田呈瑞，马守磊，等. 绿原酸的研究进展[J].食品工业科技，2009，30(5)：341-345.

[6]李杰，王学廷，吴银萍，等. 金银花中绿原酸提取方法的研究进展[J].安徽农业科学，2014，42(16)：4 969-4 970.

[7]王萌，王建成，刘钧宁，等. HPLC 法测定不同加工方法金银花中绿原酸和木犀草苷的含量[J].药学研究，2014，33(5)：261-263.

[8]张卫佳，程红，李伟倩，等. 超声波提取绿原酸的工艺研究[J].广东化工，2014，41(7)：52-55.