四乙酰化龙胆苦苷理化性质研究*

★ 曾文雪 宋晓玲 江泽慧 熊耀坤 王跃生

(1. 江西中医药大学 江西 南昌 330006；2. 南昌大学第一附属医院 江西 南昌 330006；3. 中国中医科学院中药所 北京 100700)

药物的理化性质是药物分子结构的综合体现，它不仅是药物呈现生物活性的一个重要因素，而且它密切关系着药物的稳定性、毒副作用、剂型及临床使用等[1]。四乙酰化龙胆苦苷为龙胆苦苷四乙酰化产物，与龙胆苦苷具有相似的药理活性，可发挥保肝利胆的作用。故本文通过前期研究制备的四乙酰化龙胆苦苷，对其理化性质进行研究，包括熔点、表观溶解度、表观油水分配系数、稳定性等，为后续的开发利用奠定基础。

1 仪器与试剂

SCL-10AVP shimadzu高效液相色谱仪(SPD-M10AVP 紫外检测器、SIL-10ADVP自动进样器)；齐勒管熔点测定仪；SHZ-82气浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司)； LS-2000A低温恒温光照仪(上海黄海药检所)；LRH-250-S恒温恒湿培养箱(广东医疗器械厂)；101-3-BS-Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；AR-5120电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；四乙酰化龙胆苦苷(自制，纯度大于98%)；乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 熔点测定 取干燥至恒重的四乙酰化龙胆苦苷，用熔点毛细管制样，于熔点仪上检测，平行3份，以平均值作为检测值，结果为137.9℃。龙胆苦苷的熔点为191℃，说明龙胆苦苷结构中引入乙酰基后，熔点降低。

2.2 表观溶解度测定

2.2.1 标准曲线的绘制 色谱条件：以Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)为固定相；以乙腈-水(55∶45)为流动相；检测波长为270 nm；流速为1.0 mL/min。

对照品溶液的配制：取四乙酰化龙胆苦苷(纯度>98%)适量，精密称定，加乙腈溶解，配成浓度为0.531 mg/mL的标准溶液。精密吸取标准溶液1 mL，用乙腈稀释至10 mL，得龙胆苦苷乙酰化产物的浓度为0.0531 mg/mL。

线性考察：自动进样器吸取2，5，8，10，15，20，30 μL对照品溶液进行测定，记录峰面积。以质量(Y)和峰面积(X)做线性回归，得到回归方程为Y=1×10-6X-0.0143 (r=0.9999)，结果表明，四乙酰化龙胆苦苷质量在0.1062×10-3～1.593×10-3mg范围内，线性关系良好。

2.2.2 不同溶剂中的表观溶解度测定 在10 mL具塞磨口试管中，分别加入4 mL以下溶剂：甲醇、乙醇、乙腈、水。取四乙酰化龙胆苦苷加入以上溶剂中，直至管壁挂有不溶解物为止。将所有试管盖上塞子密闭，置于振荡器中振荡，温度(25±1)℃，于24，48，72 h取样，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，液相检测，计算四乙酰化龙胆苦苷在不同溶剂中的溶解度。结果见表1。四乙酰化龙胆苦苷在水中的表观溶解度为0.11mg/mL，说明四乙酰化龙胆苦苷极微溶于水，且在溶解较慢。在有机溶剂中四乙酰化龙胆苦苷的表观溶解度随着溶剂非极性的增加显著增加，在氯仿中的表观溶解度比在水中大了10 000多倍。

表1 四乙酰化龙胆苦苷在不同溶剂中的表观溶解度(mg/mL，±s，n=3)

2.3 表观油/水分配系数测定 准确量取70 mL水饱和的正辛醇，加入一定量的四乙酰化龙胆苦苷，超声溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤，进HPLC检测，测得浓度作为总浓度(C总)。精密吸取5 mL经过滤的水饱和正辛醇含药溶液至3个玻璃管中，都加入正辛醇饱和的水溶液5 mL。置于振荡器中振荡，温度(37±1)℃，72 h后，分别吸取醇层及水层，经0.45 μm滤膜过滤，进样检测。正辛醇层、水层中含量分别为1.95±0.04，0.078±0.003mg/mL，lgP为1.40。

2.4 稳定性考察

2.4.1 高温试验 将一定量白色粉末状供试品置于培养皿中，摊成≤5mm厚的薄层，60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，观察外观，检测含量[2]。实验结果表明，四乙酰化龙胆苦苷在高温条件下放置10天，外观由白色粉末变成淡黄色团状，含量具有显著变化，结果表明四乙酰化龙胆苦苷对温度敏感。结果见表2。

表2 高温试验结果±s，n=3)

2.4.2 高湿度试验 将一定量白色粉末状供试品置于培养皿中，摊成≤5mm厚的薄层，置于恒湿干燥器中，干燥器下部放置KNO3饱和溶液形成相对湿度92.5%的恒湿条件。供试品在高湿度条件下放置10天，于第5天和第10天取样，观察外观，称量吸湿增重及检测含量。实验结果表明，四乙酰化龙胆苦苷在高湿条件下放置10天，外观未见明显改变，含量无显著变化，且第5天、第10天吸湿率均小于0.1%，结果表明四乙酰化龙胆苦苷对湿度不敏感。结果见表3。

表3 高湿度试验结果±s，n=3)

2.4.3 强光照射试验 将一定量供试品置于培养皿中，摊成≤5mm厚的薄层，置于装有日光灯的光照箱内，于照度为4500±500lx的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，观察外观，检测含量。结果见表4。结果表明，四乙酰化龙胆苦苷在高温条件下放置10天，外观未见明显改变，含量有一定下降，表明四乙酰化龙胆苦苷对强光敏感。

表4 强光照射试验结果±s，n=3)

2.4.4 不同pH条件下的稳定性 精密称取5 mg四乙酰龙胆苦苷于10 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得四乙酰龙胆苦苷储备液。取储备液1 mL于10 mL容量瓶中，加入37℃恒温水浴中预热的pH 2.0、5.0、6.8、7.8～8.0磷酸盐缓冲液及pH 1.2盐酸溶液至刻度，摇匀，至37℃恒温水浴，于0,1,2,4,6,8,12,24 h取样0.5 mL，冰浴终止反应，放至室温后，经0.45 μm微孔滤膜过滤，进行HPLC测定。结果表明，四乙酰化龙胆苦苷在酸性条件下易降解，在pH1.2和pH2.0磷酸盐缓冲液中12 h内降解均大于50%，随着pH值增加，四乙酰化龙胆苦苷降解减少。结果见图1。

图1 在不同pH溶剂中的含量变化

3 讨论

3.1 四乙酰化龙胆苦苷在水中的表观溶解度仅为0.11mg/mL，说明四乙酰化龙胆苦苷微溶于水，而且在水中溶解较慢，48h达到溶解平衡。龙胆苦苷在水中的表观溶解度为76.5mg/mL[3]，龙胆苦苷结构中引入四个乙酰基后，水溶性大大降低。四乙酰化龙胆苦苷在乙醇中溶解较慢，达到平衡溶解时间较长，在甲醇中溶解较快，但溶解度比乙醇中小。易溶于乙腈和氯仿中。

3.2 本文采用操作简单的摇瓶法测定四乙酰化龙胆苦苷的油/水分配系数，试验选用正辛醇为模拟生物膜相的有机溶剂，主要是因为正辛醇极性与多数有机体液的极性相差不大，其溶解度参数与生物膜的溶解度参数 21.07 MPa1/2一致[4]。过低的P值(logP<-2)，化合物不能穿过脂质膜；相反，过高的P值(logP>3，化合物因为脂溶性强很难从细胞另一侧的膜释放出来，故药物的最佳P值在-1

[1]张平平.磺酸钠葛根素的合成及其相关理化性质的研究[D].重庆大学,2007:32.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典﹒二部[S].北京:中国医药科技出版社,2010,附录XIX: 附录199.

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[4]Wang YL,Jia XB,Li X. Determination of equilibrium solubility of icariin and its apparent oil/water partition coefficient[J].China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,2008,9:779.

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