HPLC法同时测定复方制剂中乌头类生物碱含量

★ 王一涵 于洋 许文迪 董雪莲

(长春中医药大学 吉林 长春 130117)

该复方制剂为临床经验方，是由红参、附子、甘草等组成的复方中药制剂，具有益气养血、通阳复脉之功效，主要用于治疗阳气血弱之心悸病[1]。该制剂现有的质量标准只以甘草中甘草苷为质量评价指标，控制其质量。但其组方中附子即为君药又为毒性药物，有必要对其毒性成份进行限定，以确保其用药安全。本文旨在建立高效液相色谱法同时测定复方制剂中乌头类生物碱成份的含量测定方法，完善其质量控制指标，为临床安全用药奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦1260高效液相色谱仪，EL204电子天平(万分之一)，XS205电子天平(十万分之一)，GKC-11-CR2电子恒温水浴锅(500W)。

1.2 试药 本实验所用标准品均来自于中国药品生物制品检定所：苯甲酰新乌头原碱对照品(111795-200901)；苯甲酰乌头原碱对照品(111794-200901)；苯甲酰次乌头原碱对照品(111796-200901)；乌头碱对照品(110720-201111)；新乌头碱对照品(110799-200505)；次乌头碱对照品(110798-200404)；甲醇、乙腈、四氢呋喃为色谱纯；乙醚、甲醇、盐酸等为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Tc-C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相A：乙腈-四氢呋喃(25∶15)；流动相B：0.1mol/L乙酸铵溶液(每1 000mL加0.7mL冰醋酸)[2-5]。洗脱程序：0～48min,15%→26%A；48～49min，26%→35%A；49～58min，35%A；58～65min，35%→15%A；65～95min，15%A。柱温25℃，流速0.8mL/min，检测波长235nm。

2.2 混合对照品溶液配制 精密称取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、乌头碱对照品、新乌头碱对照品、次乌头碱对照品4.98，4.96，3.99，4.92，5.08，4.96mg，加0.05%盐酸-甲醇溶液(V/V)定容于50mL容量瓶内，分别配制成质量浓度为0.0993，0.0978，0.0794，0.0972，0.1016，0.0992mg/mL的对照品母液。分别精密移取上述母液各1mL置于容量瓶内混合均匀，0.22μm微孔滤膜过滤，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取本品粉末，过60目筛，精密称取3g，置150mL锥形瓶内，加4.5mL氨试液润湿30min。精密加入100mL乙醚，称定重量，水浴40℃加热回流15min，立即冷却，加乙醚补足失重，密封放置12h，过滤，残渣加乙醚洗涤两次，每次10mL，合并乙醚液置于蒸发皿内50℃低温蒸干，残渣加0.05%盐酸-甲醇溶液(V/V)溶解，定容至5mL容量瓶内，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2，5，8，10，15，20，25μL，注入液相色谱仪中，以进样量(μg)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，得六混标线性回归方程如下表1。

表1 回归方程和线性范围

2.4.2 精密度考察 精密吸取混合对照品溶液10μL，照2.1项下色谱条件测定，连续6次，记录峰面积，计算苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的RSD值分别为：2.8053%，1.7093%，2.7583%，2.3620%，1.6608%，2.6190%，结果表明精密度良好。

2.4.3 稳定性考察 取同一混标溶液分别于0，3，6，12，24，36h按上述液相色谱条件进行测定，得峰面积计算RSD值分别为：2.33%，2.35%，2.66%，1.15%，2.12%，1.44%，结果表明在36h内稳定性良好。取同一供试品溶液同上方法测定，计算苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、次乌头碱RSD值分别为：1.61%，1.25%，1.98%，3.02%，表明稳定性良好。

2.4.4 重现性考察 取样品粉末6份，按2.3项下供试品方法处理，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量。苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、次乌头碱平均含量分别为：2.1366，0.3903，0.7561，0.0358mg/g，RSD值分别为1.04%，1.59%，0.90%，2.49%，结果表明重现性良好。

2.4.5 加样回收率考察 取已知含量样品粉末6份，精密称定约0.25g，分别精密加入一定量的苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、次乌头碱，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、次乌头碱平均加样回收率分别为：102.14%(RSD2.90%)，100.86%(RSD2.73%)，101.49%(RSD1.02%)，101.71%(RSD2.39%)。

2.4.6 样品含量测定 取三批不同样品，按供试品溶液方法制备，按2.1项下色谱条件测定，结果该颗粒中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、次乌头碱含量见表2。

表2 三批复方制剂中乌头类生物碱含量 /μg·g-1

3 讨论

目前对于附子生物碱类成份含量测定方法的文献报道并不少见。孙兰[6]等采用乙腈-碱性乙酸铵缓冲溶液为流动相达到了分离效果，但分离时间在65min以上较长，同时碱性(pH=10)流动相不适用于普通色谱柱。陈东安[7]等虽然大大缩短了分离时间，但其分离效果并不十分理想，同时其采用C18固相萃取小柱进行供试品处理过于繁琐。本实验所建立的乌头类生物碱的含量测定方法具有良好的线性关系，科学稳定，高效灵敏，对附子相关制剂质量控制具有一定意义。

本文在药典方法的基础上，对流速、流动相等色谱条件稍加改动，达到了良好的分离效果。对于提取方法的优化本文做了大量实验对比，最终确定乙醚为提取溶剂。采用低温水浴加热回流法，较之前的浸泡法大大提高了效率，同时避免了超声法随时间水温增加不易控制的弊病，节约了时间，增加了提取效率。采用0.05%盐酸甲醇为溶剂，减少了对色谱峰的干扰，分离度较好。本实验所采用的梯度洗脱程序科学合理，使色谱峰之间都能达到良好分离，同时分离时间适中，50min内即可完成分离，且避免了梯度洗脱普遍易出现的基线漂移现象。

附子由于经过长时间水煎煮等工艺环节后，强毒性的新乌头碱、乌头碱受热水解成单酯型乌头碱而检测不出。强毒性的次乌头碱大部分也都水解了，成品中次乌头碱含量仅仅为1.6μg/g。强毒性生物碱的总含量远远低于药典规定50多倍，表明该复方制剂临床应用安全可靠。测得复方制剂中三种单酯型生物碱总含量均高于药典规定最低限值，表明该复方制剂疗效可靠，其含量平均值为52.74μg/g，下浮20%，最终确定复方颗粒三种无毒单酯型生物碱含量下限为不少于40μg/g。本文对复方制剂中附子成份做了含量限定，对其质量评价指标进行补充，为今后该复方制剂控制奠定了基础。

[1]孙佳欣.强心复脉颗粒制备工艺及质量标准研究[D].长春:长春中医药大学,2012:8-46.

[2]国家药典委员会.中国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010:177.

[3]Zhi-Hong Jiang,Ying Xie,Hua Zhou.Quantification of Aconitum Alkaloids in Aconite roots by a modified RP-HPLC method phytochem icalanalysis[J].Phytochem.Anal,2005(16):415-421.

[4]Liu Hui,Su Juan,Yang Xi,et al.A novel approach to characterize chemical consistency of Traditional ChineseMedicine Fuzi Lizhong pills by GC-MS and RRLC-Q-TOFMS[J].Chinese J Nat Med,2011,9(4):267.

[5]邵峰,俞瑜,任刚,等.HPLC同时测定附子理中丸中3种单酯型生物碱含量[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(16):57-60.

[6]孙兰,周海燕,赵润怀,等.HPLC法同时测定附子中6种单酯和双酯型生物碱[J].中草药,2009,40(1):131-134.

[7]陈东安,易进海,黄志芳,等.附子煎煮过程中酯型生物碱含量的动态变化[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(3):64-68.