桔梗药材指纹图谱研究

★ 李福龙 罗娟敏 张文惠 肖雪

(1.江西中烟工业有限责任公司技术研发中心 江西 南昌 330006；2.江西中医药大学 江西 南昌 330096；3.中山大学南沙研究院 广东 广州 511458)

桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，其味苦、辛，性平，归肺经，有开宣肺气，祛痰排脓之功效。临床上用于治疗咳嗽痰多，胸闷不畅，咽痛，音哑，肺痈吐痰，疮疡脓成不溃等症。主要化学成分为齐墩果酸型五环三萜皂苷，桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D等，其他尚含有黄酮、聚炔、甾体、酚酸、脂肪酸等类型的化合物。本实验采用HPLC法建立了桔梗药材的指纹图谱。经方法学验证，该方法具良好稳定性、重现性，符合指纹图谱测定要求；运用国家药典委员会研发的相似度计算软件，对13批桔梗药材指纹图谱进行了相似度评价，结果相似度良好，该法可用于桔梗药材的质量控制研究。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，Chemstation色谱工作站，Dionex C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。

1.2 试药 乙腈(TEDIA公司，色谱纯)，甲酸(TEDIA公司，色谱纯)，Milli Q超纯水(自制)；桔梗标准药材(购自中国药品生物制品检定所，批号：121028-201210)，桔梗药材分别购于安徽亳州药材市场及南昌汇仁堂药店，经江西中医药大学汪国华教授鉴定均为Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，按中国药典2010年版一部第259页桔梗项下方法检测均为合格产品。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Dionex C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)二元系统梯度洗脱；梯度洗脱程序见表1；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；检测波长：210nm；进样量：10μL；梯度洗脱运行70min，记录0～70min的色谱图。

2.2 供试品溶液的制备 取干燥桔梗，粉碎，过三号筛，于60℃恒温干燥箱中干燥3h，冷至室温，精密称取1g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇30mL，超声30min，滤过，收集滤液，滤渣中再精密加入50%甲醇30mL，超声30min，滤过，合并滤液，置水浴中蒸干，用甲醇定容至50mL量瓶中，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，备用。

表1 梯度洗脱表

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录色谱图，考察各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果各共有峰的相对保留时间的RSD为0.01%～0.35%，相对峰面积的RSD值为2.18%～4.85%。表明本实验仪器的精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，1，2，4，8，12，24h进色谱分析，记录色谱图，考察各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果各共有色谱峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.64%，相对峰面积的RSD为1.27%～4.76%，说明样品在常温实验条件下稳定性较好，在24h内能保证实验结果的稳定可靠。

2.3.3 重复性试验 取同一供试品，重复制备6份供试品溶液，考察色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的一致性。结果各共有色谱峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.37%，相对峰面积的RSD值为1.21%～4.38%，结果说明此方法结果可重复性良好。

2.4 测定方法 分别精密量取各批次供试品溶液10μL，注入液相色谱，记录色谱图，见图1。

2.5 实验结果 利用上述指纹图谱测定方法，对13个桔梗药材进行指纹图谱检测。标定了15个共有峰，将13个桔梗药材指纹图谱的AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究2009版》，生成对照指纹图谱，见图2，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱R的相似度，结果见表2。相似度计算结果显示，13个桔梗药材指纹图谱相似度均大于0.9，表明本法对不同产地的桔梗药材样品的相似度较高。

图1 13个桔梗药材样品指纹图谱

图2 对照指纹图谱

表2 13个桔梗药材指纹图谱相似度

3 讨论

3.1 实验过程中曾经选用Dionex C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱、Phenomenex C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱、Agilent C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱、WATERS C18(3.9mm×150mm,5μm)柱试验，结果表明Dionex C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱对桔梗药材的分离效果最好。对不同品牌或同一品牌不同型号的仪器进行了考察，如：Agilent 1200、Agilent 1100、Waters 2695HPLC，结果表明不同厂家的仪器获得的色谱图相似度良好，说明本方法能适用于不同的液相色谱仪。对流动相中的酸性添加剂的品种进行试验，分别测试了甲酸、乙酸、磷酸添加剂，结果添加磷酸后整体峰形和分离度等多个指标得到优化，故选择磷酸作添加剂。再分别测定0.05%、0.1%、0.15%的磷酸水溶液为水相的色谱图，通过比较发现0.1%磷酸水体系分离效果最佳。

3.2 用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对13个桔梗药材样品生成的对照指纹图谱，并计算13个桔梗药材的相似度，结果均大于0.9，表明该法可为桔梗药材的质量控制方法提供参考。

3.3 桔梗主要含有皂苷，其总皂苷的提取物可添加至烟丝中，可起到平衡水份的保润作用。