EZH2与PCNA、P16蛋白在胃癌组织中表达的关系和意义

高德全 赵彦婷 刘云云 冀增海

·论著·

EZH2与PCNA、P16蛋白在胃癌组织中表达的关系和意义

高德全 赵彦婷 刘云云 冀增海

目的检测EZH2、增殖细胞核抗原(PCNA)、P16蛋白在胃癌及癌旁正常组织中的表达情况，分析EZH2与患者临床病理特征及预后的关系。方法收集62例胃癌手术患者的肿瘤及52例癌旁正常胃粘膜组织石蜡标本进行免疫组织化学染色，并收集患者的临床病理特征及随访资料，同时检测PCNA、P16蛋白的表达，分析这3种蛋白质之间的关系；分析EZH2与胃癌患者临床病理特征及预后的关系。结果胃癌组织中EZH2、PCNA表达均较癌旁组织明显增强(P<0.05)，P16蛋白在胃癌组织中表达明显低于癌旁组织阳性率(P<0.05)；胃癌组织中EZH2与PCNA表达有正相关关系(r=0.3846，P=0.002)，EZH2与P16蛋白表达存在负相关关系(r=-0.2756，P<0.05)；PCNA与P16表达无明显相关关系(P>0.05)。EZH2表达与胃癌肿瘤浸润深度、分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)；预后分析显示，EZH2强表达患者的生存期比弱表达者明显缩短(P<0.05)。结论胃癌组织中EZH2蛋白表达明显增高，与胃癌部分临床病理特征有关，EZH2蛋白还可以作为预后指标；EZH2蛋白在胃癌中的作用可能与其调节肿瘤细胞增殖能力有关。

胃癌；果蝇zeste 基因增强子同源物2；增殖细胞核抗原；P16蛋白；临床病理特征；预后

胃癌是我国发病率、病死率最高的消化道恶性肿瘤，对人民健康危害极大，但胃癌并无特异性临床表现，很难早期发现，患者就诊时多已处于进展期，手术及化疗效果不佳，预后较差。目前胃癌发病机制尚不明确，寻找与胃癌发生进展关系密切的基因有可能作为新肿瘤标志物对胃癌进行诊断及预后预测，还可能确定肿瘤生物治疗靶点。此类研究已成为胃癌研究热点，但尚未取得突破性进展。果蝇zeste 基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是新近发现的原癌基因，与多种恶性肿瘤发生进展有关[1-3]，但关于EZH2蛋白与胃癌临床病理特征及预后关系的研究还比较少见。故本研究应用免疫组化技术检测比较了EZH2蛋白在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达情况，同时分析了EZH2表达与胃癌临床病理特征各指标之间的关系，并探讨EZH2蛋白与胃癌预后的关系；同时应用免疫组化技术检测了与胃癌组织中与肿瘤增殖关系密切的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、P16蛋白的表达，探讨了EZH2蛋白与PCNA、P16的关系及其意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2005年8月至2011年7月确诊为胃癌行手术切除肿瘤并术后病理证实的患者胃癌石蜡标本62例，其中52例有癌旁正常组织。所有患者临床病理资料完整，患者术前均未接受放、化治疗，均有术后随访资料。其中男48例，女14例；年龄37～72岁，平均年龄(59.2±11.3)岁。兔抗人EZH2、PCNA、P16多克隆抗体均购自美国Abcam公司，免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术公司。

1.2 免疫组化染色 组织均为4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋后4 μm连续切片，进行苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)和免疫组化SP染色。切片经脱蜡水化、3%过氧化氢孵育、蒸馏水冲洗等过程后PBS浸泡进行抗原修复。免疫组化试剂盒操作过程：封闭、分别加入各一抗、孵育、冲洗后依次加二抗和辣根酶标记链霉卵白素工作液。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树脂封片。

1.3 免疫组化结果判断标准 SP染色结果由两位病理专业医师双盲阅片判断。每张切片随机取5个400倍视野，每视野计数100个细胞，根据细胞染色的阳性率计算评分。EZH2、PCNA蛋白以细胞核出现黄褐色或棕褐色为染色阳性，P16蛋白以细胞浆或细胞膜出现黄褐色或棕褐色为染色阳性。记分标准如下：细胞内阳性表达率<10%记为阴性，阳性细胞表达≥10%记为阳性。

1.4 统计学分析 应用SAS 8.0统计软件，计数资料采用χ2检验、Spearman相关分析、Kaplan-Meier生存分析方法对实验数据进行处理，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌与癌旁正常组织中EZH2、PCNA、P16的免疫组化结果 免疫组化结果显示，胃癌组织EZH2、PCNA表达与癌旁正常组织比较明显增高，P16在胃癌组织中表达明显低于癌旁正常组织(P<0.05)。见表1。Spearman相关结果显示，胃癌组织中EZH2与PCNA表达存在正相关关系(r=0.3846，P=0.002)，EZH2与P16表达有负相关关系(r=-0.2756，P=0.030)；PCNA与P16表达无明显相关关系(r=-0.2108，P=0.100)。

表1 EZH2、PCNA、P16在胃癌和癌旁组织中表达情况 例

2.2 EZH2蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系 单因素分析显示，EZH2蛋白与胃癌肿瘤浸润深度、分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。EZH2蛋白与性别、年龄、肿瘤直径、神经血管侵犯、远处转移等特征无明显关系(P>0.05)。见表2。

表2 胃癌组织EZH2表达与肿瘤临床病理特征的关系 例

2.3 EZH2蛋白表达与胃癌患者预后的关系 62例胃癌患者有51例得到随访，随访截止日期为2011年8月，随访率为82.3%。应用Kaplan-Meier生存分析检验，EZH2蛋白表达阳性患者的平均生存期为(20.17±1.92)月，EZH2阴性者平均生存期为(31.90±3.09)月，2组比较差异有统计学意义(χ2= 5.944,P=0.0148)。见图1。

3 讨论

胃癌由于起病隐匿、特异性症状不明显，不易早期诊断。且胃癌进展迅速，患者出现症状就诊时往往已处于中晚期，综合治疗效果不佳。近年胃癌手术、化疗技术虽有了较大进步，但我国胃癌患者5年生存率仍仅为30%～40%。由于胃癌发病机制尚不明确，因此寻找与胃癌发生进展有关的新基因意义重大。EZH2即是受到关注的基因之一。研究显示，EZH2蛋白具有癌基因特征，在多种恶性肿瘤中表达上调，EZH2基因可促进肿瘤的增殖、侵袭、血管生成能力，与膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌等肿瘤进展有关[1,4,5]。而有关EZH2蛋白与胃癌临床病理特征及预后关系的研究目前尚不多见。本结果发现，EZH2蛋白在胃癌组织中表达比癌旁正常组织增强，说明EZH2可能促进胃癌肿瘤的发生、进展。对EZH2蛋白与胃癌各项临床病理特征的关系进行分析，结果发现EZH2蛋白表达阳性的患者与EZH2蛋白阴性者相比肿瘤浸润更深、分化程度更差、临床分期更晚、淋巴结转移率更高，这说明EZH2蛋白可能促进胃癌转移进展。进一步预后分析显示，EZH2蛋白表达阳性的胃癌患者生存期较阴性者短，提示EZH2蛋白可以作为胃癌预后指标。但本研究样本量较小，有待进一步扩大研究规模并进行前瞻性研究，以便对EZH2蛋白在胃癌中的临床意义予以阐明。

图1 EZH2表达与胃癌患者预后关系的Kaplan-Meier生存分析结果

为了解EZH2蛋白促进胃癌细胞增殖的机制，本研究同时检测了与直接反映肿瘤细胞增殖能力的PCNA、P16蛋白的表达。肿瘤细胞中PCNA表达增强，该蛋白在分裂期细胞中表达增高，在静止期细胞中无明显表达，可作为评价细胞增殖状态的指标，直接反映细胞的增殖状态。研究表明，PCNA在恶性肿瘤中通过促进肿瘤细胞增殖而使肿瘤进展[6,7]。有研究显示，恶性肿瘤中EZH2蛋白可通过促进PCNA表达而促进肿瘤细胞的增殖[8]。本结果显示，PCNA在胃癌

中的表达强于癌旁组织，EZH2蛋白与PCNA表达有正相关关系，与前述报道的结果符合。P16蛋白特异性作用于细胞周期G1期，可以阻止G1期细胞进入S期从而抑制细胞增殖。P16蛋白功能缺失可导致细胞过度增殖甚至癌变，多种恶性肿瘤中P16蛋白表达均明显降低[9,10]。本研究也证实P16蛋白在胃癌中表达明显低于癌旁组织，且EZH2与P16蛋白有负相关关系，提示EZH2可能通过抑制P16蛋白而发挥促进胃癌细胞增殖作用，但具体机制还需要进行深入研究。

本研究发现EZH2蛋白表达与胃癌部分临床病理特征有关系，EZH2蛋白阳性表达可作为胃癌不良预后因子。EZH2蛋白参与胃癌进展可能与EZH2蛋白调节PCNA、P16表达有关。但本研究样本量较小，且仅对临床现象进行了观察分析，具体机制还不明确。因此，进一步研究中我们准备扩大样本数，并对EZH2蛋白进行功能和机制研究，阐明EZH2蛋白在胃癌中的具体作用。

1 Li K,Liu C,Zhou B,et al.Role of EZH2 in the Growth of Prostate Cancer Stem Cells Isolated from LNCaP Cells.Int J Mol Sci,2013,14:11981-11993.

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6 Ou JM,Qui MK,Dai YX,et al.Combined blockade of AKT/mTOR pathway inhibits growth of human hemangioma via downregulation of proliferating cell nuclear antigen.Int J Immunopathol Pharmacol,2012,25:945-953.

7 Zafar H,Ali S.Boron inhibits the proliferating cell nuclear antigen index,molybdenum containing proteins and ameliorates oxidative stress in hepatocellular carcinoma.Arch Biochem Biophys,2013,529:66-74.

8 French BA,Oliva J,Bardag-Gorce F,et al.Mallory-Denk bodies form when EZH2/H3K27me3 fails to methylate DNA in the nuclei of human and mice liver cells.Exp Mol Pathol,2012,92:318-326.

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10 Saito Y,Yoshida M,Ushiku T,et al.Prognostic value of p16 expression and alcohol consumption in Japanese patients with oropharyngeal squamous cell carcinoma.Cancer,2013,119:2005-2011.

ThesignificanceofexpressionofEZH2,PCNA,P16ingastriccanceranditscorrelationwithpatient’sprognosis

GAODequan*,ZHAOYanting,LIUYunyun,etal.*TheFirstDepartmentofSurgery,People’sHospitalofPingshanCounty,Hebei,Pingshan050400,China

ObjectiveTo investigate the significance of expression of EZH2,proliferating cell nuclear antigen (PCNA),P16 in gastric cancer tissues and its correlation with clinicopathological characteristics and prognosis of patients.MethodsThe expression levels of EZH2,PCNA,P16 were tested by immunohistochemistry in 62 cases of gastric cancer tissues and 52 cases of tumor-adjacent tissues,and patients’ clinicopathological characteristics and follow-up data were collected.The correlation among the three kinds of proteins was analyzed,and the relationship between EZH2 and clinicopathological characteristics as well as prognosis of patients was analyzed.ResultsThe expression levels of EZH2 (69.35%) and PCNA (83.87%) in gastric cancer tissues were significantly higher than those (21.15%,38.46%) in tumor-adjacent tissues (P<0.05),however,the expression levels of P16 (33.87%) in gastric cancer tissues were significantly lower than those in tumor-adjacent tissues (73.08%,P<0.05).The expression levels of EZH2 were positively correlated with those of PCNA in gastric cancer tissues,however,the expression levels of EZH2 were negatively correlated to those of P16 (P<0.05),moreover,there was no obvious relationship between the expression of PCNA and that of P16 (P>0.05).The overexpression of EZH2 was related to the depth of tumor infiltration,differentiation degree,clinical TNM stage,lymph node metastasis (P<0.05).Prognosis analysis showed that that the survival duration in patients with overexpression of EZH2 was obviously shorter than that of patients with weak expression of EZH2 (P<0.05).ConclusionThe overexpression of EZH2 appears in gastric cancer tissues,which is related to clinicopathological characteristics of gastric cancer,moreover,EZH2 protein can be served as an index of prognosis evaluation,and its effect in gastric cancer may be correlated to regulating proliferation ability of tumor cells.

gastric cancer;enhancer of zeste homolog 2;proliferating cell nuclear antigen;P16 protein;clinicopathological characteristics;prognosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.003

050400 河北省平山县人民医院外一科(高德全)，妇科(赵彦婷)，骨科(刘云云)，外三科(冀增海)

R 735.2

A

1002-7386(2014)04-0492-03

2013-09-12)