免疫胶体金法与培养方法检测沙门氏菌检测结果研究

刘景武 付素兰 任天红 张荣 张蕊 孙文泽

·论著·

免疫胶体金法与培养方法检测沙门氏菌检测结果研究

刘景武 付素兰 任天红 张荣 张蕊 孙文泽

目的评价自制沙门氏菌胶体金试纸对沙门氏菌检测的真实性、可靠性和实用性．探讨其用于沙门氏菌引起的食物中毒临床标本的快速检测的应用价值。方法用培养法作为金标准，并用胶体金方法对同一份标本进行检测，对胶体金方法的诊断试验的评价指标作出计算。结果两种方法的检测结果之间有极好的一致性(Φ=0.903，Kappa=0.898)，胶体金法诊断沙门氏菌与金标准方法的差异无统计学意义(P>0.05)，胶体金法检测沙门氏菌诊断试验的灵敏度为81.8%，特异性为100%，符合率为99.6%，阳性预测值为100%，阴性预测值为99.6%，假阴性率为18.2%，假阳性率为0。结论胶体金法在基层、和突发公共卫生事件时，在对沙门氏菌检测工作中具有一定的应用价值．该方法的特异性高，一致性也较高，但其灵敏度仍有待提高。

沙门氏菌；免疫胶体金；培养；诊断试验

沙门氏菌是肠杆菌科中的一个重要菌属，是人和动物的常见病原菌。可引起人类多种疾病，如食物中毒、胃肠炎、菌血症、肠热症等。目前，对于沙门氏菌有很多检测方法，如免疫学方法、分子生物学方法、以及传统的金标准培养方法。但是，在应对突发公共卫生事件时，快速准确的判断病原菌，成为诊疗的关键。虽然传统的沙门氏菌检测方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7 d才能完成。而近几年发展起来的胶体金免疫快速检测法，是利用抗体胶体金标记技术和膜层析技术研制而成，用于定性检测标本中的沙门氏菌。该法操作简单，检测结果清晰，易于判断，可广泛应用于临床和基层医疗单位对可疑沙门氏菌标本的快速检测[1-4]。为了探讨快速法在临床标本中的使用价值，我们对自制的沙门氏菌免疫胶体金试纸条与培养方法进行比较，并对检测结果进行分析，以确定其在沙门氏菌引起腹泻的诊断价值，以满足临床需要。

1 材料与方法

1.1 试剂 SS、EMB购自购自北京市陆桥技术有限公司。沙门氏菌诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司。细菌生化鉴定板购自珠海迪尔生物工程有限公司。细菌生化鉴定仪购自珠海迪尔生物工程有限公司。沙门氏菌免疫层析条由本实验室自制。

1.2 标本 标本为2011年5月至 2012年10月间，我院门诊和病房腹泻患者粪便标本共520例。其中男性患者300例,女性220例；年龄7～75岁,平均年龄35岁。

1.3 方法

1.3.1 培养方法：取粪便标本接种到SS、EMB培养基上，35℃培养18～24 h，挑取可疑菌落，分离纯化，同时做初步鉴定，同时用沙门氏菌多价血清(A-F)群进行分群，最后用纯化的菌做生化鉴定，用沙门氏菌诊断血清鉴定到种。

1.3.2 沙门氏菌免疫层析条检测[5-7]：取1 g(1 ml)标本加9 ml0.9%氯化钠溶液混匀，500×g离心5 min。吸取上清液加入另一灭菌离心管中以14 000×g，离心10 min，沉淀用500 ml0.9%氯化钠溶液悬浮 。在沸水中煮沸半小时。然后再用沙门氏菌免疫层析条检测。实验设阴阳性对照，以生理盐水为阴性对照，结果判读，检测线和质控线同时出现为阳性，只出现质控线，为阴性，只出现检测线，而无质控线，需重做。用培养的方法和免疫胶体金法同时对520例标本进行检测，以培养法为标准，对检测结果进行对比分析。

1.4 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件，用四格表评价免疫胶体金法检测的敏感性、特异性和准确性，计数资料采用χ2检验比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 用培养的方法和免疫胶体金法同时对520例标本进行检测，其中培养的方法检出11例阳性标本,509例阴性标本,而用免疫胶体金法检测出9份阳性标本, 511例阴性标本。见表1。

独立性检验(pearsonx2检验)结果：N=520，pearsonx2=94．214，P=0.000，两种沙门氏菌检测方法的结果不独立，说明两种检测方法所得结果之间具有关联性，其列联系数中为0.903，可认为两种检测结果之间存在正关联性；Kappa值为0.898，表明两种方法的检测结果之间的一致性为优。

表1 免疫胶体金法检测的结果与培养方法比较

配对设计的Mc Nemerx2检验结果Mc Nemerx2P值为0.500，因此认为胶体金法诊断沙门氏菌与金标准方法检测结果之间的差异没有统计学意义。

2.2 常用诊断试验评价指标的计算结果 自制沙门氏菌免疫胶体金试纸条的特异性为100%，灵敏度为81.8%。Youden指数越接近1，说明其诊断价值越大，本试剂的Youden指数为 81.8%，说明其诊断价值比较高。该试纸条与培养方法相比符合率达到99.6%。见表2。

表2 胶体金法诊断沙门氏菌试验的评价指标

3 讨论

通过实验可知自制沙门氏菌胶体金试纸条与培养方法相比较其诊断的灵敏度为81.8%，特异性为100%，假阳性率为0；假阴性率为18.2%，符合率达到99.6%。

目前，对于沙门氏菌有很多检测方法，如免疫学方法、分子生物学方法、以及传统的金标准培养方法。但是，在应对突发公共卫生事件时，快速准确的判断病原菌，成为诊疗的关键。虽然传统的沙门氏菌检测方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7 d才能完成，已不能达到令人满意的效果。分子生物学方法，虽然灵敏度高，可是操作繁琐，技术性强，对人员要求严格，也不适合现场大规模应用，而免疫胶体金技术，以其操作简单、检测时间短、不需专业培训就能满足检测的特点，非常适合突发公共卫生事件时，快速检测目的。但是该方法灵敏度低，受方法学限制，从方法学上提高灵敏度，不太可能，所以在临床标本检测中，能不能通过建立一套前处理方法，以达到去除影响因子，提高灵敏度的目的呢？本研究使用自制沙门氏菌免疫胶体金试纸条，对粪便标本进行检测，同时，实验将密度梯度离心法和煮沸处理相结合，采用密度梯度离心法，去除了粪便中大部分的颗粒物，再经过煮沸处理，菌体破裂，暴露的抗体结合位点增多，并且颗粒变小后，在纤维素膜上的涌动速度变快，从而大大提高了阳性检出时间和检出限，整个检测时间在一小时内完成，基本能满足突发公共卫生事件的要求，达到快速、准确的检测目的[10，11]。

胶体金方法作为一种免疫学方法具有快捷迅速，大大缩短出结果时间；操作简便，不需任何仪器和设备；试剂稳定，外界因素影响较小；成本低廉，所需试剂和样本量少的特点越来越受到科学家的关注，并成功应用于一些临床检测。但是在应用中也暴漏出一个问题，那就是通过计算发现胶体金法诊断沙门氏菌的灵敏度为81.8%，灵敏度则有待提高，容易造成漏诊。所以在实际工作中只能做为辅助方法，不能代替培养的方法，在今后的工作中，我们将寻求改进的方法提高其灵敏度。

1 谌志强，段惠莉，王新为，等．大肠埃希菌O157：H7的胶体金免疫渗滤法检测．中国公共卫生, 2005，21：705-706．

2 Duan HL，Shen ZQ，Wang XW，et al．Preparation of immunomagnetic iron-dextran nanoparticles and application in rapid isolation of E.coli O157 from foods．J World Journal of Gastroenterology，2005，11：3660-3664．

3 王中民，李君文，王新为，等．胶体金免疫层析法快速检测沙门氏菌.微生物学免疫学进展，2004，32：36-38．

4 唐景峰,李晓艳.布病胶体金免疫层析检测方法的建立.中国生物制品学杂志,2007,20:119-122.

5 熊国华，于莉.单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测.中国公共卫生,2008,24:248-249.

6 贾慧，田秀梅.胶体金快速法检测粪便幽门螺杆菌分泌蛋白的临床应用评价.吉林医学,2009,30:2629-2630.

7 王璞，陈保文.斑点免疫金渗滤法检测抗荚膜组织胞浆茵抗体的研究.第三军医大学学报,2007,29:1979-1981.

8 李少彤，栾玉明.胶体金法快速检测霍乱弧菌诊断试验的研究设计与分析.中国卫生检验杂志,2006,16:269-271.

9 许青田,崔中锋.胶体金标记免疫层析法快速诊断霍乱临床研究.中国误诊学杂志,2002,2:900-901.

10 刘景武，付素兰，任天红，等.沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条检测腹泻病人粪便中沙门氏菌的研究.中国卫生检验杂志，2014，24:66-67.

11 刘景武，付素兰，任天红，等.沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制.河北医药，2013，35:3493-3494.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.024

050011 河北省石家庄市第三医院检验科

R 378.22

A

1002-7386(2014)07-1021-02

2013-10-30)