骨髓间充质干细胞减缓急性百草枯中毒肺损伤

熊剑飞 朱长清 张柯基 吕利雄

·论著·

骨髓间充质干细胞减缓急性百草枯中毒肺损伤

熊剑飞 朱长清 张柯基 吕利雄

目的通过骨髓间充质干细胞(BMSCs)的植入，观察其能否减缓急性百草枯中毒肺损伤。方法72只雌性大鼠随机分为3组：百草枯组、BMSCs治疗组、正常对照组，将体外分离和培养的BMSCs通过尾静脉注入3组大鼠体内，观察2周内3组大鼠的生存状况、血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)的水平变化和3组肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平。结果与百草枯组相比，BMSCs治疗组可明显延长大鼠的生存期，降低血浆中TNF-α、IL-1β的含量(P<0.01)，升高GSH-PX的水平(P<0.01)，减少血浆中MDA的水平(P<0．01)，降低肺组织α-SMA表达水平(P<0.05)。结论BMSCs可减缓急性百草枯中毒引起的肺损伤。

骨髓间充质干细胞；百草枯；肺损伤；中毒

百草枯是一种有高度毒性的脱叶剂和除草剂，易溶于水。由于无意或故意摄入百草枯，急性百草枯中毒仍时有发生。其中毒主要累及肺脏，急性肺损伤是其典型改变，可引起一系列脂质过氧化反应和炎性反应，短期存活者常因晚期进行性肺纤维化、呼吸衰竭而死亡。由于目前尚无特效解毒药物和有效的治疗方法，百草枯中毒的病死率仍居高不下。多年来，国内外许多专家、学者对百草枯中毒机制进行了深入细致的研究，一直在努力寻找比较有效的治疗方法，但至今前景不明[1]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多相分化潜能的成体干细胞，体外培养的BMSCs 有快速黏附和克隆能力和高度可塑性,能够向不同谱系的细胞分化，如肝细胞、心肌细胞、肾小球细胞、神经元细胞，成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、星形胶质细胞等，这已被众多的体外及体内实验证实。近年来动物实验发现骨髓来源的BMSCs可以向损伤肺脏迁移，直接或间接参与急性肺损伤的修复重建，对急性肺损伤有较好的治疗效果，因而有可能为急性肺损伤的治疗带来新的希望[2，3]。本研究通过BMSCs的植入，观察其能否减缓急性百草枯中毒肺损伤，初步探讨BMSCs对急性百草枯中毒的影响，为临床应用提供实验依据。由于大部分患者死于顽固性低氧血症及肺纤维化,所以如何有效地阻止肺损伤进一步恶化显得十分关键，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD 大鼠3只，体重(60±5)g；雌性SD大鼠72只，体重(200±10)g(上海中医药大学动物实验中心)。质量分数为20%的百草枯水剂(500 g/L，天津施普乐农药技术发展有限公司)。DMEM-F12 (Hyclone公司)， 胎牛血清(Hyclone公司)，Percoll 分离液(Sigma公司)，FITC anti-mouseCD34、CD45、CD44 和CD166(美国Biolegend公司)。大鼠IL-1β和TNF-αELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分离、培养与鉴定：将雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下取大鼠股骨和胫骨，无菌条件下取大鼠双侧股骨和胫骨，剔除骨表面附着的肌肉组织，在无菌洁净工作台中用无菌5 ml注射器抽取不含FBS的DMEM/F12培养液反复冲洗所取骨之髓腔，尽可能将骨髓组织多冲出。然后将冲出的骨髓细胞轻轻吹打制成单细胞悬液，用Percoll分离液分离后，将细胞重悬于10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，按1×105/cm2接种于25 cm2塑料培养瓶中， 置于37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培养。培养24 h后弃掉未贴壁细胞，贴壁细胞初期为单个圆形细胞，3～5 d后逐渐可见为梭形或多边形明显的集落生长。以后每2～3天换液1次，细胞长至80%～90%汇合后，大多数呈较均匀的梭形或纺锤形，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化1 min，加适量血清终止消化，离心后重悬，按1∶3传代。取第3代细胞，流式细胞仪检测第3代细胞表达CD44、CD166,CD34和CD45不表达，表明获得的贴壁细胞为BMSCs。

1.2.2 实验动物分组和处理：受体动物是雌性SD大鼠，随机分3组：①百草枯组(n=24)：大鼠腹腔注射20%百草枯溶液15 mg/kg。②BMSCs治疗组(n=24)：百草枯注射同百草枯组，6 h后经尾静脉注射BMSCs 1×106/只(0.5 ml)。③正常对照组(n=24)：大鼠腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。

1.2.3 检测指标与方法:观察百草枯组和BMSCs治疗组大鼠在注射后2周内的活动、进食表现并记录存活天数。3组大鼠在注射后3、7、14 d处死，将收集的血浆用相应的试剂盒测定IL-1β、TNF-α、MDA和GSH-PX的水平。百草枯组大鼠存活时间短于14 d，故只收集百草枯注射后3、7 d血浆。同时分离并取出肺脏，取右肺中叶置入10%中性甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，3组大鼠肺组织行免疫组化测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平。使用Leica图像自动分析系统对经α-SMA抗体免疫组化处理的切片100倍拍摄，每张切片拍摄6个不同视野，所得图像进行进一步分析，计算每个视野中α-SMA所占比例，6个视野所得百分比相加求得算术平均数，以此平均数代表每张切片中α-SMA所占比例，从而获得肺组织α-SMA定量数据。

2 结果

2.1 BMSCs 的体外培养与鉴定 采用全骨髓法分离大鼠骨髓间充质干细胞，24 h后第1次换液，即可见较多细胞贴壁，细胞形态多为短棒状，少数为多角形，可见少数细胞集落形成，但细胞仍混杂有较多的血细胞，经2～3次换液后，第5～6天绝大部分贴壁细胞形成集落，造血系细胞已明显减少，细胞形态基本一致，呈长梭形，部分呈多角形。随培养时间延长，贴壁细胞迅速增殖、数量日益增加，第8～10天细胞贴附紧密，呈长梭形，胞体中央可见胞核，待细胞铺满培养瓶底的80%～90%时可进行传代培养。传代后细胞在培养瓶中均匀生长，形态更为一致，梭形外观。传代细胞比原代细胞贴壁快,24 h内已全部贴壁、伸展,增殖迅速,均匀分布生长,传至第三代时细胞形态比较均一。流式细胞仪检测第3代细胞表达CD44、CD166、CD34 和CD45 不表达，表明获得的贴壁细胞为BMSCs。

2.2 大鼠生存状况和存活天数的观察 百草枯组中，百草枯腹腔注射24～48 h后大鼠逐渐出现活动减少，进食少、呼吸频率增快，存活最短时间是6 d，存活最长时间是12 d， 大鼠的平均存活天数是9.2 d。BMSCs治疗组中，观察的14 d中大鼠均存活，在注射后的前3 d内活动进食减少、呼吸频率较快，但7 d后上述症状有所缓解。

2.3 3组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β含量变化 与正常对照组相比， 百草枯组和BMSCs治疗组中血浆TNF-α和IL-1β的含量均显著上升(P<0.01)。在BMSCs治疗组中，注射后3 d血浆TNF-α和IL-1β的含量与百草枯相比差异无统计学意义(P>0.05)。在BMSCs治疗组注射后7 d血浆TNF-α和IL-1β的含量显著低于百草枯组(P<0.01)，到注射后14 d BMSCs 治疗组炎性介质的含量有进一步下降。BMSCs治疗组在各时段与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组别 IL⁃1β3d(n=8)7d(n=8)14d(n=8)TNF⁃α3d(n=8)7d(n=8)14d(n=8)百草枯组46．78±4．52∗112．36±7．91∗-135．32±11．76∗252．75±13．21∗-BMSCs治疗组45．25±5．63∗79．75±5．82∗#31．69±2．86∗134．65±9．25∗144．84±10．73∗#65．20±6．64∗正常对照组-11．98±3．66-35．96±3．83--

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与百草枯组比较，#P<0.01

2.4 3组大鼠血浆中GSH-PX和MDA水平变化 与正常对照组比较，百草枯组和BMSCs 治疗组中注射3 d大鼠血浆中GSH-PX 水平显著下降(P<0.01)，而MDA水平显著上升(P<0.01)；但与百草枯组相比，BMSCs 治疗组中在注射7 d后，MDA水平开始下降(P<0.01)，GSH-PX水平明显回升(P<0.01)。BMSCs治疗组在各时段与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别 MDA(nmol/ml)3d(n=8)7d(n=8)14d(n=8)GSH⁃PX(U/ml)3d(n=8)7d(n=8)14d(n=8)百草枯组4．58±0．63∗5．39±0．72∗-68．37±8．29∗40．38±4．19∗-BMSCs治疗组4．45±0．58∗4．05±0．22∗#3．36±0．26∗66．47±7．69∗#89．71±6．32∗#113．27±9．04∗正常对照组-3．02±0．16--120．34±4．74-

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与百草枯组比较，#P<0.01

2.5 3组肺组织α-SMA表达水平 免疫组化显示与正常对照组相比，百草枯组和BMSCs治疗组肺组织α-SMA表达水平均显著上升(P<0.01)。但在BMSCs治疗组中，注射后7 d肺组织α-SMA表达显著低于百草枯组(P<0.05)。BMSCs对照组肺组织α-SMA表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3 。

组别α⁃SMA表达百草枯组43．01±2．49∗BMSCs治疗组35．14±2．85∗#正常对照组22．87±3．16

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与百草枯组比较，#P<0.05

3 讨论

目前认为由于Ⅱ型肺泡细胞对百草枯有主动摄取和蓄积作用，使得肺脏成为此类中毒损害的主要靶器官。摄入百草枯后，通常2 h之内血浆浓度达到顶峰。而肺组织的百草枯浓度是血浆浓度的10～20倍[4]。百草枯作用于细胞的氧化还原反应，在细胞内活化为氧自由基是其中毒作用的基础。所形成的过量超氧化阴离子自由基及过氧化氢等可引起肺、肝、肾及其他许多组织器官细胞膜脂质过氧化，从而造成多系统、多器官的损害。因为肺泡细胞对百草枯具有主动摄取和蓄积的特点，故肺组织中含量很高，且在5～7 h肺内百草枯浓度达到峰值，存留时间也非常久，所以肺损伤也最为明显，早期可引起肺充血、出血、水肿、透明膜形成等改变，后期可出现肺纤维化。肺纤维化多发生在中毒后5～10 d，2～3周达到高峰，最终导致呼吸衰竭而死亡。有研究表明百草枯中毒的程度与肺组织中百草枯浓度有关[5]。因为急性肺损伤是导致百草枯急性中毒患者死亡的主要原因，所以救治的主要内容就是治疗中毒继发的急性肺损伤。近年来，国内也多次进行对百草枯中毒治疗的大样本临床观察和研究，试图找到有效的综合治疗方案，但一直没有找到突破口。当前临床上主要通过洗胃、导泻、口服活性炭或漂白土等尽快清除胃肠道残留毒物，减少再吸收，血液净化治疗清除血液中的百草枯，但对于已进入重要器官和组织内的百草枯效果差；使用大剂量的糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗，但疗效不切确，且不良反应明显。通过上述的综合治疗，虽然延长了中毒患者的存活时间，但并没有明显改变病死率。随着近年来BMSCs研究的不断进展，BMSCs技术在肺损伤领域的基础研究和临床应用前景也越来越受到关注。BMSCs有取材方便、再生能力强、细胞增殖快和操作简单等优点。研究发现在受到电离辐射时，BMSCs有良好的自由基清除能力[6]。另有研究发现人类来源的BMSCs可移植到动物体内，说明BMSCs的低免疫原性，能逃避宿主的免疫排斥[7]。有学者发现BMSCs还有免疫调节作用，能抑制受体体内炎性介质的释放[8]。已有研究显示BMSCs 可聚集到肺损伤部位，分化并修复肺泡上皮细胞，减轻炎性反应[9]。上述的研究结果为BMSCs应用于百草枯中毒的治疗提供了可能性。本研究结果显示：BMSCs植入后7 d使百草枯中毒大鼠血浆中炎性介质IL-1β和TNF-α含量显著降低，14 d内大鼠均存活，提示其具有抑制炎性介质释放、减轻炎性反应和延长生存期的能力。而植入后3 d，BMSCs治疗组与百草枯组大鼠血浆中炎性介质IL-1β和TNF-α含量无显著性差异，说明BMSCs植入后起作用需要一定的时间。

百草枯中毒导致急性肺损伤的机制尚未完全阐明，目前主要理论之一即氧自由基损伤理论，百草枯进入组织后通过氧化还原过程产生大量氧自由基，诱导脂质过氧化，损害细胞，导致细胞变形坏死。MDA是机体内氧自由基代谢中产生的脂质过氧化产物，GSH-PX是体内重要的自由基清除剂，本研究显示BMSCs的植入7 d后，大鼠体内MDA水平较百草枯组下降，而GSH-PX较百草枯组升高，表明机体脂质过氧化的程度下降。但在BMSCs植入第3天，BMSCs植入组MDA、GSH-PX水平与百草枯组无显著性差异，同样说明BMSCs植入后起作用需要一定的时间。至于为什么BMSCs植入早期作用不明显和植入后多长时间其作用到达高峰需要在以后实验中进一步研究。

研究表明上皮间质细胞转移是肺纤维化过程中肌成纤维细胞的一个重要来源[10]。上皮间质转化是指上皮细胞向间质细胞转化。在分子水平，上皮间质转化表现为上皮细胞标记物E-钙黏蛋白的丢失，而出现肌成纤维细胞标记物α-SMA。本结果表明使用BMSCs后，肺组织α-SMA表达下降，提示BMSCs 的植入能减缓百草枯所致的肺纤维化。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.037

200127 上海市，上海交通大学医学院附属仁济医院急诊科

朱长清，200127 上海交通大学医学院附属仁济医院；

E-mail: zhucq1965@126.com

R 781.66

A

1002-7386(2014)21-3295-04

2014-04-18)