DKK-1和β-catenin在近端胃腺癌中的表达及临床意义

杨学丽 路三军 魏娉 安欣 尹峰 孙健

·论著·

DKK-1和β-catenin在近端胃腺癌中的表达及临床意义

杨学丽 路三军 魏娉 安欣 尹峰 孙健

目的探讨DKK-1(Dickkopf-1)和β-catenin 在近端胃腺癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学SP 法检测61 例近端胃腺癌组织中DKK-1 和β-catenin 表达情况，并结合近端胃腺癌的临床病理特征进行分析。结果在61 例近端胃腺癌组织中，DKK-1 阳性表达率和β-catenin 异常表达率分别为34.4%(21/61)和68.9%(42/61)。DKK-1的表达在肿瘤的分化程度、临床分期及淋巴结转移方面差异有统计学意义(P<0.05)；β-catenin的表达在肿瘤的分化程度方面差异有统计学意义(P<0.05)。在近端胃腺癌中DKK-1 和β-catenin 的表达存在关联性(P<0.05)。结论DKK-1 的表达上调可能在近端胃腺癌的发生、发展中发挥一定的作用并可提示预后及转移，它与β-catenin可能存在调节及负反馈调节。

DKK-1；β-catenin；近端胃腺癌；分化；转移

近端胃腺癌是指肿瘤位于近端胃组织，且完全位于在食管胃交界下方。目前认为它来源于胃，但是它又与其他部位的胃癌不同，在流行病学背景、解剖学组织学特性、临床表现及分子概况等方面不同于远端胃癌[1]。DKK-1是一种分泌型蛋白，作为Wnt/β-catenin信号传导通路的调控因子而被广泛关注。最早发现于非洲蟾蜍胚胎细胞内，在诱导胚胎头部发育的过程中期重要作用。目前研究表明DKK-1在多种肿瘤中表达异常[2-5]。 β-catenin 作为Wnt/β-catenin 信号传导通路的关键分子，启动靶基因转录，导致细胞增殖、侵袭和转移。β-catenin在细胞中起不同的作用:(1)组成细胞粘附/肌动蛋白细胞骨架网络的结构成分;(2)游离型β-catenin作为信号转导分子在基因转录中起作用。此外，β-catenin介导细胞增生或抗凋亡基因的表达。本研究采用免疫组织化学SP 法检测近端胃腺癌中DKK-1 和β-catenin蛋白的表达并分析其临床意义，明确近端胃腺癌发生、发展及转移机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 61例近端胃腺癌石蜡组织标本取自2011年5月至2012年6月我院病理科，患者术前均无放化疗史；其中男45例，女16例；年龄42～80岁；平均年龄63.7岁；肉眼观察肿瘤主体位于胃上部，且未侵及食管；肿瘤侵及浅肌层9例，侵及深肌层32例，侵及浆膜层20例；其中高分化癌12 例，中分化癌34 例，低分化癌15 例；其中Ⅰ/Ⅱ期28 例，Ⅲ/Ⅳ期33 例；无淋巴结转移25 例，有淋巴结转移36 例。临床病理分期以术后病理为依据，按照美国癌症联合会(AJCC) 制定的TNM分期方案；组织学分类采用世界卫生组织发表的“国际肿瘤组织分类”。

1.2 主要试剂 兔抗人DKK-1 多克隆抗体购自美国Santa Cruz 生物技术公司，兔抗人β-catenin 多克隆抗体、SP 免疫组织化学试剂盒及DAB 显色剂均购自迈新生物技术公司。

1.3 方法 将制备好的石蜡组织切片常规脱蜡，微波修复抗原，3%过氧化氢溶液以阻断内源性过氧化物酶活性。正常山羊血清封闭，分别滴加一抗为兔抗人DKK-1 多克隆抗体(1∶50)和兔抗人β-catenin 多克隆抗体(1∶100)，37℃孵育2～3 h后依次滴加山羊抗兔二抗，辣根酶标记链霉卵蛋白素。DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封固。以上试验以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。

1.4 结果判定 免疫组织化学阳性反应物为棕黄色颗粒。每张切片随机选取5 个高倍视野，每个视野计数200 个癌细胞，计数阳性细胞百分比。DKK-1 阳性表达定位于胞浆，偶有细胞核表达，根据染色程度评分，无着色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分；阳性细胞百分比，<10%为0分，10%～25%为1 分，26%～50%为2 分，>50%为3 分；将细胞染色程度计分与阳性百分数计分相加即为综合评分，积分为0～2分，表示阴性(-)；3～4 分为阳性(+)；5～6分为强阳性(++)；后两者均视为阳性表达。β-catenin按照Jawhari等的方法，染色分级标准为：细胞膜表达减少或基本消失为0分；胞浆或细胞核表达为1分；异质性表达减弱为2分；保留细胞膜的表达为3分。0～2分为异常表达，3分为正常表达。

1.5 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验及Fisher检验，作spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DKK-1 的表达与近端胃腺癌临床病理特征的关系 DKK-1 在近端胃腺癌中的阳性表达率为34.4%(21/61)。DKK-1 在不同性别、年龄的近端胃腺癌组中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。在高分化、中分化、低分化组中的表达率分别为8.3%、35.3%、60.0%，差异有统计学意义(P<0.05)。在Ⅰ/Ⅱ期及Ⅲ/Ⅳ期肺癌中的表达率分别为35.7%、63.6%，差异有统计学意义(P<0.05)。在淋巴结转移阳性组和淋巴结转移阴性组的表达率分别为69.4%、36.0%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2，表1。

2.2 β-catenin 的表达与近端胃腺癌临床病理特征的关系 β-catenin在近端胃腺癌中的异常表达率68.9%(42/61)。β-catenin的异常表达与患者的性别、年龄无关，而且在近端胃腺癌的肿瘤分期及淋巴结转移等方面差异无统计学意义(P>0.05)。在高分化、中分化、低分化组中的异常表达率分别为33.3%、73.5%、86.7%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、4，表1。

图1 DKK⁃1(免疫组化×100)

图2 DKK⁃1(免疫组化×400)

图3 β⁃catenin(免疫组化×100)

图4 β⁃catenin(免疫组化×400)

2.3 DKK-1 与β-catenin在近端胃腺癌中的相关性 对2 个指标作关联性分析发现在近端胃腺癌组织中DKK-1与β-catenin的表达存在关联性(P<0.05)。见表1。

表1 DKK-1与β-catenin在近端骨腺癌中的相关性 例(%)

3 讨论

近端胃腺癌因解剖位置的特殊性，过去被称为胃“贲门”癌，新版WHO把其归类于食管胃交界腺癌。肿瘤完全位于食管胃交界下方，未侵及食管。有研究表明近端胃腺癌与远端胃腺癌不同，它与幽门螺杆菌呈负相关[6]。幽门螺杆菌诱导性胃炎所致的胃酸下降可阻止近端胃腺癌的发生及转化。

Wnt通路是一条介导细胞生长的信号通路,在正常胚胎细胞发育过程中发挥重要作用。β-catenin位于3q21，是一种多功能的细胞内蛋白质。它在细胞内分布的改变可反映其功能变化，作为Wnt信号传导途径的重要阳性调节因子，其在胞浆/核中的表达与肿瘤的恶性转化和浸润密切相关。作为Wnt 信号途径的负调控因子，DKK-1 通过与辅助受体LRP6发生相互作用，进而抑制Wnt途径[7]。消化道肿瘤中，DKK-1在食管癌中的表达是上调的[5]。但是有研究认为胃癌组织中DKK1的表达下调[8]。其在消化道肿瘤中差异性表达的意义尚不完全清楚。

本研究采用免疫组织化学SP的方法检测61 例近端胃腺癌中DKK-1 的表达，其表达率为34.4%，大部分在胞浆中表达，偶有细胞核中表达。结果显示随着近端胃腺癌的分化程度降低，DKK-1 的表达也随之升高；临床分期越晚，DKK-1 的表达也明显升高；结果显示DKK-1与肿瘤的分化程度及分期密切相关；而淋巴结转移阳性组高于阴性组者，提示DKK1的过表达能够增加细胞的侵袭能力。本研究的结果与Kuang等[9，10]的研究结果相吻合。

本研究显示β-catenin 在近端胃腺癌中的异常表达率68.9%。在高分化、中分化、低分化组中的异常表达率分别为33.3%、71.5%、86.7%，低分化癌细胞膜表达减弱或缺失，并出现胞浆、细胞核的表达，这与Cheng等[11，12]研究结果一致。提示β-catenin的异常表达可能会影响肿瘤的分化程度。β-catenin 降解过程的任何异常都有可能导致其异常表达和聚集。而且有人发现在远处转移的GC 细胞中不表达β-catenin,并且认为正是由于缺失β-catenin,故无法与E-cahherin 形成复合体,导致细胞黏附功能降低或丧失,使肿瘤细胞易发生浸润和转移。

总之，DKK-1 在近端胃腺癌中呈高表达，其表达与β-catenin的异常表达存在关联性(P<0.05)。我们推测高表达的DKK-1 可能与Wnt 信号失控或负反馈机制有关。有关DKK-1与细胞增殖、细胞周期的关系已有相关的报道[13，14],具体的作用机制有待进一步深入的研究。研究表明DKK-1能够提高食管癌细胞的侵袭能力,在肿瘤发生转移的过程中具有促进作用[15]；本研究从蛋白水平进一步支持了近端胃腺癌在组织发生、发展机制上更接近于食管癌，不同于远端胃癌。DKK-1在低分化癌及淋巴结转移中表达上调，提示其可作为评判肿瘤分化程度及检测预后的指标。DKK-1与Wnt/β-catenin的具体调控机制,需要我们扩大样本量，并在分子水平上进一步进行深入探讨。

1 Stemmermann GN,Nomura AMY,Kolones LN,et al.Gastric carcinoma in a multiethnic population.Cancer,2002,95:744.

2 Hirata H,Hinoda Y,Nakajima K,et al.Wnt antagonist DKK1 acts as a tumor suppressor gene that induces apoptosis and inhibits proliferation in human renal cell carcinoma.Int J Cancer 2011,128: 1793-1803.

3 Lemaire O,Attal M,Bourin P,et al.DKK1 correlates with response and predicts rapid relapse after autologous stem cell transplantation in multiple myeloma.Eur J Haematol 2010,84: 276-277.

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5 Daigo Y,Nakamura Y.From cancer genomics to thoracic oncology: discovery of new biomarkers and therapeutic targets for lung and esophageal carcinoma.Gen Thorac Cardiovasc Surg,2008,56:43-53.

6 Silberg DG,Swain GP,Suh ER,et al.Cdx1 and Cdx2 expression during intestinal development.Gastroenterology,2000,119:961.

7 Wang J,Shou J,Chen X.Dickkopf-1,an inhibitor of the Wnt signaling pathway,is induced by p53.Oncogene,2000,19:1843-1848.

8 Sato H,Suzuki H,Toyota M,et al.Frequent epigenetic inactivation of DICKKOPF family genes in human gastrointestinal tumors.Carcinogenesis,2007,28:2459-2466.

9 Kuang HB,Miao CL,Guo WX,et al.Dickkopf-1 enhances migration of HEK293 cell by beta-catenin/E-cadherin degradation.Front Biosci,2009,14: 2212-2220.

10 Mitchell E,Menezes,Daniel J,et al.Dickkopf1: a tumor suppressor or metastasis promoter.International Journal of Cancer,2012,130: 1477-1483.

11 Cheng XX,Wang ZC,Chen XY,et al.Correlat ion of Wn t2 expression and Catenin in trcellular accumulation in Chinese gastric cancer: relevance with tumour dissemin ation.Cancer Lett,2005,223:339- 347.

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13 Sikandar S,Dizon D,Shen X,et al.The class I HDAC inhibitor MGCD0103 induces cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer initiating cells by upregulating Dickkopf-1 and noncanonical Wnt signaling.Oncotarget，2010,1:596-605.

14 Macdonald LJ,Sales KJ,Grant V,et al.Prokineticin 1 induces Dickkopf 1 expression and regulates cell proliferation and decidualization in the human endometrium.Mol Hum Reprod,2011,17：626-636.

15 Li SJ,Qin XB,Liu B,et al.Dickkopf-1 is involved in invasive growth of esophageal cancer cells.J Mol Hist,2011,42:491-498.

ExpressionandclinicalsignificanceofDKK-1andβ-catenininproximalgastriccancer

YANGXueli,LUSanjun,WEIPing,etal.

DepartmentofPathology,TheFirstHospitalofHandanCity,Hebei,Handan056002,China

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of dickkopf-1(DKK-1) and β-catenin in proximal gastric cancer.MethodsThe expression of DKK-1 and β-catenin in proximal gastric cancer was detected by immunohistochemistry (SP) in 61 cases of proximal gastric cancer,and the detection results combined with clinical pathological characteristics of proximal gastric cancer were statistically analyzed.ResultsThe positive expression rate of DKK-1 and the abnormal expression rate of β-catenin in proximal gastric cancer tissue were 34.4%(21/61)and 68.9%(42/61),respectively.The expression of DKK-1 was closely correlated to the degree of tumor differentiation,clinical staging and lymph node metastasis(P<0.05).The expression of β-catenin was significantly associated with the degree of tumor differentiation(P<0.05).The expression of DKK-1 was closely correlated with that of β-catenin in proximal gastric cancer (P<0.05).ConclusionThe overexpression of DKK-1 may play an important role in the pathogenesis and development of proximal gastric cancer,which can indicate prognosis and metastasis of tumor.The relation between DKK-1 and β-catenin may be regulation each other and negative feedback regulation.

dickkopf-1；β-catenin；proximal gastric adenocarcinoma；differentiation;metastasis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.004

056002 河北省邯郸市第一医院病理科

路三军， 056002 河北省邯郸市第一医院病理科；

E-mail：lusanjun211@163.com

R 735.2

A

1002-7386(2014)21-3214-03

2014-05-11)