趋化因子受体CXCR4、PTEN在结肠黏液腺癌中的表达及临床意义

张剑虹 张飞 张晓丽 张凡 刘博

·论著·

趋化因子受体CXCR4、PTEN在结肠黏液腺癌中的表达及临床意义

张剑虹 张飞 张晓丽 张凡 刘博

目的探讨趋化因子受体CXCR4和PTEN蛋白在结肠黏液腺癌中的表达及其与癌转移及预后的关系。方法采用免疫组织化学及组织芯片技术，检测25例结肠正常组织、92例大肠黏液腺癌组织及癌旁组织中PTEN蛋白和趋化因子受体CXCR4的表达情况，并与临床资料对比分析。结果PTEN蛋白在结肠黏液腺癌的表达率为31.52%(29/92)，在癌组织和癌旁组织的表达率明显低于正常结肠组织，差异有统计学意义(P<0.05);趋化因子受体CXCR4在结肠黏液腺癌的表达率为61.95%(57/92)，在癌组织和癌旁组织的表达率明显高于正常结肠组织，差异有统计学意义(P<0.01)。PTEN蛋白、CXCR4与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和临床分期显著相关(P<0.05)。结论趋化因子受体CXCR4和PTEN蛋白的过表达与结肠癌的浸润、转移相关，且它们在其浸润转移中具有相关性，常态化检测有利与结肠黏液腺癌的治疗。

趋化因子受体；PTEN；组织芯片；结肠黏液腺癌

结肠黏液腺癌恶性度高，预后差。它的浸润和转移是造成患者死亡的主要原因。肿瘤细胞的侵袭、转移与多种细胞因子有关，趋化因子受体CXCR4和PTEN蛋白对恶性肿瘤的转移所起的作用越来越受到重视。本文通过检测92例结肠黏液腺癌患者及25例正常结肠组织中CXCR4和PTEN蛋白的表达情况，探讨两者间相互关系及是否与癌细胞的侵袭、转移相关，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集河北北方学院附属第一医院2010至2012年手术切除结肠黏液腺癌切除石蜡标本92例，结肠黏液腺癌的诊断标准按WHO肠道肿瘤组织学分型进行，所有样本切片均经组织学证实。其中男47例，女45例；年龄33～69岁，平均51岁；<45岁41例，≥45岁51例；按肿瘤大小分类：≥5 cm 43例，<5 cm 49例；按病理分化程度分类：高分化42例、中低分化50例；浸润深度至黏膜肌层38例，浸润深度至浆膜层54例；伴有淋巴结转移58例，无淋巴结转移34例。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期45例、Ⅲ～Ⅳ期47例；所有患者术前均未化疗，放疗，内分泌治疗。同时收集结肠正常组织25例。癌旁组织为距癌组织边缘大于5 cm处取材。

1.2 组织芯片制备 组织芯片委托试剂公司在天津肿瘤医院肿瘤研究所完成，过程如下：组织载玻片经过夜泡酸，充分清洗并烘干，用多聚赖氨酸行防脱片处理，对每一组织标本，观察HE切片，选取目标组织并在HE切片及其相应石蜡组织块(供体蜡块)上标记，莱卡石蜡空白蜡块(受体蜡块)与蜂蜡混合(比例为1∶1)，制成2.2 cm×3.5 cm×1 cm大小蜡块，用加拿大生产CDX718组织芯片仪打孔制成带孔空白蜡块，将蜡块放在39～42℃水浴中软化后，用组织芯片仪从供体蜡块标记部位逐个取出直径1 mm高4 mm的组织柱，推入空白蜡块预先设计的相应孔内，这样在空白蜡块上制作完成了68个组织芯片，为防止染色过程中脱片，每例标本上样四个点，分别安插在空白蜡块1和2中，对蜡块进行连续切片，裱于防脱片处理的载玻片上。

1.3 免疫组织化学方法 即用型CXCR4、PTEN单克隆抗体及SP法免疫组织化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物试剂有限公司，组织经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，HE染色，光镜分期，采用S-P法，进行免疫组化染色，主要免疫组织化学步骤：石蜡包埋组织切片4 μm厚，常规脱蜡至水，0.3%过氧化氢室温下10 min,以阻断内源性过氧化物酶；充分水洗，与pH值6.0的柠檬酸缓冲液中高压锅处理10 min后，室温冷却；非免疫羊血清封闭10 min后，加入即用型鼠单抗CXCR4、PTEN，4℃冰箱过夜，再加入生物素化羊抗鼠IgG和S-P复合物。以DAB液显色，苏木素复染，常规脱水，透明，封片。用TBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。

1.4 结果判断 CXCR4蛋白阳性染色分别为细胞膜和(或)细胞质中呈棕黄色颗粒。采用半定量积分法判断阳性结果。染色强度评分：无染色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；高倍镜(×400)下随机对每张切片取10个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞占同类细胞的百分数：细胞阳性率为0、<25%、25～50%、>50%,分别评为0分、1分、2分、3分。两种积分乘积<2记为阴性，>2记为阳性。 PTEN阳性表达定位于细胞膜和(或)细胞质。阳性反应显示为出现黄色或棕黄色颗粒。肿瘤细胞阳性染色细胞数≤25%为阴性表达，>25%为阳性表达。

1.5 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR4和PTEN在结肠黏液腺癌及癌旁组织中的表达 CXCR4在92例结肠黏液腺癌组织中阳性表达率为61.95%(57/92)，表达部位在细胞膜和(或)细胞质中，阳性反应显示为出现黄色或棕黄色颗粒；CXCR4在结肠黏液腺癌、癌旁组织的阳性表达高于结肠正常组织，其表达分别为61.95%、40.21%、12.00%，差异有统计学意义(P<0.01)。PTEN在正常结肠组织，癌旁组织，结肠癌组织均有不同程度表达，阳性表达定位于细胞膜和(或)细胞质。PTEN在结肠正常组织，癌旁组织、癌组织中的表达率分别为76.00%、45.65%、31.52%。PTEN在结肠正常组织的表达明显高于癌旁组织和癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2，表1。

图1 结肠黏液腺癌CXCR4的表达(SP×200)

图2 结肠黏液腺癌PTEN的表达(SP×200)

表1 CXCR4和PTEN在结肠黏液腺不同组织中的表达 例(%)

注：与正常组织比较，*P<0.05，#P<0.01

2.2 结肠黏液腺癌CXCR4和PTEN阳性表达与结肠黏液腺癌临床病理因素关系 CXCR4在癌组织浸润至浆膜组CXCR4的表达高于浸润至黏膜肌层组；中低分化结肠黏液腺癌阳性表达高于高分化组；有肠系膜淋巴结转移的结肠黏液腺癌阳性表达高于无肠系膜淋巴结转移者组；TNM分期Ⅲ～Ⅳ期结肠黏液腺癌阳性表达高于Ⅰ～Ⅱ期。两两相比差异有统计学意义(P<0.05)。PTEN在癌组织浸润至浆膜组PTEN的表达低于浸润至黏膜肌层组；中低分化结肠黏液腺癌阳性表达低于高分化组；有肠系膜淋巴结转移的结肠黏液腺癌阳性表达低于无肠系膜淋巴结转移者组；TNM分期Ⅲ～Ⅳ期结肠黏液腺癌阳性表达低于Ⅰ～Ⅱ期；2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。CXCR4和PTEN阳性表达率与结肠黏液腺癌的性别、年龄和肿瘤的大小无明显相关性(P>0.05)。见表2。

3 讨论

结肠黏液腺癌是消化道常见的恶性肿瘤，以癌细胞内、癌细胞外产生大量黏液为其特点，它侵袭性强，转移率高。预测肿瘤复发与转移、评估结肠黏液腺癌的预后是提高患者生存率的关键。

表2 CXCR4和PTEN在结肠黏液腺癌中的表达与临床指标的关系 例(%)

注：与对应项目比较，*P<0.05

CXCR4是趋化因子CXCR12的受体，在肿瘤细胞移位、浸润和转移中发挥着重要作用[1]，CXCR12与其特异性受体CXCR4所构成的CXCR12-CXCR4生物学轴(CXCR12-CXCR4 biological axis)是细胞间信息传递、细胞迁徙有密切关系的偶联分子对，关于CXCR4在肿瘤细胞中的表达各家报道不一，Kodama等[2]发现子宫颈癌的CXCR4 的表达越高，淋巴结越容易发生转移， CXCR4可以评价患者预后。Yasumoto等[3]发现有骨转移和脑转移的晚期前列腺癌细胞株中均有CXCR4高表达。本研究将正常结肠黏膜与癌旁组织、癌组织中的CXCR4表达率相比较，CXCR4在结肠黏液腺癌、癌旁组织的阳性表达高于结肠正常组织，说明CXCR4高表达可能与结肠黏液腺癌的形成和发展有一定关联。癌细胞的病理分级可以反映其恶性程度大小：分化程度越低，则恶性程度越高，本实验CXCR4在中低分化结肠黏液腺癌表达高于高分化组；TNM分期能折射出肿瘤进展，分期越高，癌细胞浸润和转移越容易出现，本实验CXCR4 在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期结肠黏液腺癌阳性表达高于Ⅰ～Ⅱ期；同时结肠黏液腺癌浸润至浆膜的CXCR4表达率明显高于浸润至黏膜肌层的病例，而CXCR4的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小无关。由此可见，CXCR4可能促进了结肠黏液腺癌的浸润和发展，在CXCR12-CXCR4生物学轴的作用下，过表达CXCR4的结肠黏液腺癌逆浓度梯度转移至分泌CXCR12较高的器官，形成器官的特异性转移。这些均表明CXCR12-CXCR4生物学轴可能推进了结肠黏液腺癌的侵袭、转移。目前对其具体作用机制还不十分清楚， 不久将来CXCR4可作为新的肿瘤标记物之一，判断结肠黏液腺癌患者的治疗及预后。

PTEN是近年发现的新的肿瘤抑制基因[4]，其通过使PIP3去磷酸化，拮抗了PKB/Akt信号系统，从而阻断了Akt及其下游激酶的活性，抑制了细胞分裂增殖，诱导细胞凋亡，从而发挥抑癌作用[5]。PTEN在结肠癌，乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤组织中不表达或低表达，这可能与该基因启动子甲基化有关。PTEN在癌细胞中表现为杂合性丢失或突变，这种基因突变或杂合性丢失使基因的原有功能发生改变，细胞不断增殖，细胞凋亡不被及时诱导，从而导致癌组织的发生、侵袭、转移。本研究发现PTEN在癌旁组织和癌组织的表达低于正常黏膜组织，表明PTEN基因的低表达，不能充分发挥抑制变异细胞分裂增殖的能力，变异细胞过度生长，导致癌块形成。本研究还发现，PTEN随着分化程度的降低、癌细胞浸润深度的加深、临床分期的增加、淋巴结转移的增多其表达逐渐减少，表明PTEN抑制了癌瘤的发生、发展，启动子甲基化导致其表达下调可能为其作用机制，因为PTEN蛋白表达下降或缺失，其抑癌功能下调，促成结肠黏液腺癌的侵袭、转移。文献报道，PTEN蛋白降低或减少与人体许多癌瘤有关，并与肿瘤大小，组织学类型、病理分级、临床TNM分期及淋巴结转移有关[6]，但本实验未发现PTEN的表达与肿瘤大小有关。由此可见PTEN与结肠黏液腺癌的发生、浸润、转移及预后密切相关，可为判断结肠黏液腺癌的恶性程度及预后提供依据[7-10]。

PTEN和CXCR4表达有何关联，是否存在呈负相关性，有待进一步探讨。总之，CXCR4表达上调和PTEN表达降低或缺失在结肠黏液腺癌的发生、发展中可能起重要作用，对判断肿瘤的恶性程度和预测预后有指导意义。

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Expressionandclinicalsignificanceofchemokinereceptor-CXCR4,PTENincolonmucinousadenocarcinoma

ZHANGJianhong*,ZHANGFei,ZHANGXiaoli,etal.

*DepartmentofPathology,TheFirstHospitalAffiliatedtoHebeiNorthUniversity,Hebei,Zhangjiakou075029,China

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of chemokine receptor-CXCR4,PTEN in colon mucinous adenocarcinoma and to explore the correlation between their expression and cancer invasion,metastasis as well as patient’s prognosis.MethodsThe expression levels of PTEN protein and CXCR4 were detected by immunohistochemistry in 20 cases of normal colon tissues,92 cases of colorectal mucinous adenocarcinoma and the tissues beside cancer.The detection results were contrastively analyzed with clinical data.ResultsThe positive expression rate of PTEN protein in colon mucinous adenocarcinoma was 31.52%(29/92),which in cancer tissue and the tissues beside cancer was significantly lower than that in normal colon tissue (P<0.05).The positive expression rate of CXCR4 in colon mucinous adenocarcinoma was 61.95%(57/92),which in cancer tissue and the tissues beside cancer was significantly higher than that in normal colon tissue (P<0.01).The expressions of PTEN protein and CXCR4 were closely correlated to the infiltration depth of cancer,lymph node metastasis and tumor staging(P<0.05).ConclusionThe overexpression of chemokine receptor CXCR4 and PTEN protein are closely related to invasion,metastasis of colon carcinoma,so routine detection of chemokine receptor CXCR4 and PTEN protein is helpful for the treatment of colon mucinous adenocarcinoma.

chemokine receptor;PTEN;tissue chip;colon mucinous adenocarcinoma

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.001

项目来源:张家口市科技局课题(编号:1021091D)

075000 河北省张家口市，河北北方学院附属第一医院病理科(张剑虹、张凡、刘博)，放疗科(张飞)；河北北方学院(张晓丽)

张晓丽，075000 河北北方学院；

E-mail:zhangxiaoli1972@163.com

R 365

A

1002-7386(2014)21-3205-04

2014-02-11)