花生废弃物中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取与分析

韩寒冰， 沈 兰， 李海航*

(1.广东石油化工学院化学与生命科学学院，茂名 525000；2.华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室,广州 510631)

白藜芦醇，化学名为3,4′,5-三羟基二苯乙烯，白藜芦醇苷是白藜芦醇的葡萄糖苷.白藜芦醇是植物体内抵抗病原菌侵染的一类重要的植物抗毒素，具有显著的抗癌抑癌、心血管保护、抗氧化和清除自由基等药理作用[1-2].研究表明，白藜芦醇通过抗氧化、抗突变、抑制环加氧酶和氢过氧化物酶的活性、诱导癌细胞分化等作用，抑制癌细胞生长、增殖和诱导癌细胞凋亡[3-4]，白藜芦醇苷在体内转化成白藜芦醇，并发挥同样的功效.白藜芦醇主要存在于虎杖、葡萄和花生中，虎杖的含量最高[5].虎杖作为名贵的中药材，提取白藜芦醇和白藜芦醇苷成本太高.研究发现，在花生的根、茎中含有白藜芦醇[6-8]，但从花生中提取、分析白藜芦醇苷的方法尚未见报道.

花生收获种子后，植株被丢弃在田间，造成资源浪费和环境污染.本研究对花生各废弃物提取的白藜芦醇和白藜芦醇苷，进行定性和定量分析，为花生废弃物资源的开发利用提供科学依据和技术基础.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

供试花生(Arachishypogaea)品种珍珠红14、粤油114、汕油523和湛油75，由广东省农业科学院花生研究室提供.2012年7月采收的花生，洗净后，取根、茎、叶和壳于50 ℃烘箱烘干，粉碎后过0.425 mm筛，备用.

甲醇(色谱纯)，超纯水，乙醇(95%食用级)，白藜芦醇和白藜芦醇苷对照品(购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%).

1.2 样品的提取

样品的提取采用溶剂浸泡提取法[6].精密称取1 g样品干粉于15 mL提取管中，加入10 mL不同体积分数(40%、50%、60%、70%、80%、90%)的乙醇水溶液，在60 ℃水浴中超声浸提1 h，2 500 r/min离心5 min，取上清液，经0.22 μm膜过滤后，用高效液相色谱进行定性和定量分析.

分析提取次数对提取效果的影响时，按以上同样的方法提取和分析.第一次提取用10倍体积(w/v)的提取溶剂，此后每次用5倍体积的提取溶剂提取，样品中白藜芦醇及其苷的定量分析用1 g材料加10倍体积(w/v)的提取溶剂提取1次，再用5倍体积的提取溶剂提取2次合并3次提取液，HPLC分析.

每个样品的定量分析至少重复3次，取平均值计算结果，并计算重复之间的标准差.

1.3 白藜芦醇和白藜芦醇苷的定性和定量分析

用岛津公司的SPD-20A高效液相色谱仪(HPLC)采用HPLC法分析提取液白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量.HPLC条件为：LC-20AT 紫外检测器，检测波长为303 nm；色谱柱为依利特ODS1柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)柱，柱温35 ℃；流动相为甲醇:超纯水(30∶70,v/v)，流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL.

定性分析通过HPLC的保留时间和样品与对照品相加实验.定量分析用不同质量浓度(5、10、15、20、25、30 μg/mL)的白藜芦醇和白藜芦醇苷对照品溶液制作浓度与峰面积标准曲线，根据样品峰的面积计算成分的含量.

2 结果与分析

2.1 花生废弃物提取液中白藜芦醇及白藜芦醇苷的鉴定

图1A为白藜芦醇和白藜芦醇苷对照品的HPLC图谱，峰1和峰2分别为白藜芦醇苷和白藜芦醇.花生提取液样品的HPLC图谱(B)中，在与对照品相应的保留时间处同样出现2个峰.且在样品与对照品相加试验(C)中，对应的2个峰面积接近对照品和样品的峰面积之和，而图谱中其余的峰值基本一样.鉴定样品中1和2号峰分别为白藜芦醇苷和白藜芦醇.

(A)白藜芦醇苷(1)和白藜芦醇(2)的对照品混合液；(B)花生根提取物；(C)对照品与花生根提取物的混合液

图1 花生根提取液中白藜芦醇苷和白藜芦醇的HPLC鉴定

Figure 1 HPLC identification of polydatin and resveratrol in peanut extracts

2.2 白藜芦醇和白藜芦醇苷的标准曲线和精密度

将不同质量浓度的白藜芦醇及白藜芦醇苷对照品溶液HPLC检测，得到2种物质的质量浓度与峰面积关系的标准曲线(图2).白藜芦醇标准曲线的线性回归方程为y=22 074x+5 546.3，相关系数R2=0.999 6(图2A).白藜芦醇苷标准曲线的线性回归方程为y=13 739x+2 867.7，相关系数R2=0.999 9(图2B).表明2种物质在5～30 μg/mL的范围内溶液质量浓度与峰面积之间有良好的线性关系.

用10 μg/mL白藜芦醇和白藜芦醇苷对照溶液连续进样5次，测得峰面积之间的RSD分别为1.2%和1.6%，表明HPLC仪器及进样精密度良好.

图2 白藜芦醇(A)和白藜芦醇苷(B)的定量标准曲线

2.3 从花生废弃物中提取白藜芦醇和白藜芦醇苷的影响因素

乙醇体积分数对珍珠红14的白藜芦醇和白藜芦醇苷提取率的影响(图3).结果表明，60%乙醇对白藜芦醇的提取率最高，50%乙醇对白藜芦醇苷的提取率最高.当乙醇体积分数超过60%时，随着乙醇体积分数的增加，2种化合物的提取率都有所降低.由于白藜芦醇苷在50%和60%乙醇时的提取率差异不大，选择60%乙醇作为提取液，可同时提取2种成分，提取率较高.

图3 乙醇体积分数对花生茎白藜芦醇和白藜芦醇苷提取量的影响

Figure 3 Effect of different concentrations of ethanol on the extraction amount of resveratrol and polydatin from peanut stem

以60%的乙醇为提取溶剂，提取珍珠红14的白藜芦醇和白藜芦醇苷，第1次提取按料液比1∶10，第2次及以后按料液比1∶5，60 ℃下超声波提取4次，HPLC分别测定各次提取液中白藜芦醇及白藜芦醇苷含量(图4).第4次提取液中2种成分均未检测到.说明前3次提取可将花生材料中的白藜芦醇及其苷全部提取出来，因此，定量分析花生材料中白藜芦醇及白藜芦醇苷的条件为用60%的乙醇、60 ℃下超声提取3次(每次1 h)，第1次按料液比1∶10，第2、3次按料液比1:5，合并3次提取液，HPLC测定提取液中白藜芦醇及白藜芦醇苷含量的结果表明，以第1次提取的含量最高.

图4 提取次数对花生茎中白藜芦醇和白藜芦醇苷提取量的影响

Figure 4 Effect of extraction times on extraction amount of resveratrol and polydatin from peanut stem

不同花生品种中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量差异很大(表1).4个花生品种中，白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量在珍珠红14中各器官中偏高，湛油75号中偏低；珍珠红14的根中2种化合物的含量分别为148.7、133.7 μg/g，与湛油75的根中的含量分别相差2.76和2.42倍.

同一品种花生的不同器官中2种化合物的含量也都有很大的差别，依次均为根>茎>叶>壳.如珍珠红14中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量在根中分别为148.7、133.7 μg/g，和果壳中的含量分别相差15.8倍和11.6倍.此外，白藜芦醇和白藜芦醇苷含量在不同品种和不同器官中有类似的分布，即含量高的品种和器官中2种化合物的含量都高，反之，含量低的品种和器官中2种化合物的含量都低，且同一材料中2种化合物的含量比较接近.

表1 花生各器官中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量Table 1 Resveratrol and polydatin contents in different peanut organs μg/g

注：表中数据为平均值±标准差,n=3.

3 讨论

研究从花生中提取白藜芦醇含量测定方法比较多[7-8]，但对花生生产中的各种废弃物中提取白藜芦醇苷未见报道.目前，研究白藜芦醇苷提取的材料是虎杖[9-10]和葡萄[11-13].同时提取和测定白藜芦醇和白藜芦醇苷的研究也主要集中在虎杖、葡萄、葡萄酒和桑椹[14-16].Sales等[17]研究紫外光和超声波提高花生仁白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量，在最优条件下，白藜芦醇含量为2.64～4.40 μg/g，总芪类的含量为4.50～6.50 μg/g，但文中并没有明确白藜芦醇苷的含量.本文同时对花生各种废弃物中的白藜芦醇和白藜芦醇苷进行了定性和定量分析，显示白藜芦醇和白藜芦醇苷都同时存在于花生的根、茎、叶和种壳中，且二者的含量比较接近.研究表明花生不同品种和不同器官中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量有很大的差异.不同品种的4种器官中都以根中含量最高.珍珠红花生根中白藜芦醇和白藜芦醇苷含量分别达到148.7、133.7 μg/g，比葡萄和桑椹等材料中的高得多.据统计，2010 年世界花生种植面积、总产量分别为2 120 万hm2和3 511万t，中国种植面积、总产量分别为440万hm2和1 520万t[18].花生种植和加工业产生大量的根、茎、叶和壳废弃物，研究花生根、茎、叶和壳等废弃物中的白藜芦醇和白藜芦醇苷，对综合开发利用花生废弃物和提高花生产业的附加值有重要的意义.

参考文献：

[1] Mertens-Talcott S U, Percival S S. Ellagic acid and quemetin interact synergistically with resveratrol in the induction of human leukemia cella[J]. Cancer Letters, 2005, 218(2): 141-151.

[2] Pan L P, Yu S L, Chen C J, et al. Cloning a peanut resveratrol synthase gene and its expression in purple sweet potato[J]. Plant Cell Reports, 2012, 31(1): 121-131.

[3] 黎永胜, 文军. 白藜芦醇的药理作用研究进展[J]. 医学综述, 2008, 14(3): 469-471.

Li Y S, Wen J. Advancement on pharmacological action of resveratrol[J]. Medical Recapitulate, 2008, 14(3): 469-471.

[4] Shih A, Davis F B, Lin H Y, et al. Resveratrol induces apoptosis in thyoid cancer cell lines via a MAPK-and p53-dependent mechanism[J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2002, 87(3): 1223-1232.

[5] 俸灵林, 郑昕, 包文芳, 等. RP-HPLC 法同时测定虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量[J]. 天然产物研究与开发, 2004, 16(6): 534-538.

Feng L L, Zheng X, Bao W F, et al. Simultaneous RP-HPLC determination of resveratrol and piceid inpolygonomcospidatumsieb. et zucc[J]. Natural Product Research and Development, 2004, 16(6): 534-538.

[6] 王方, 吕镇城, 彭永宏. 玫瑰花红色素的提取及其稳定性研究[J]. 华南师范大学学报:自然科学版, 2007(4): 103-109.

Wang F, Lü Z C, Peng Y H. Studies on the extraction and stability of pigment from roses[J]. Journal of South China Normal University:Ntaural Science Edition, 2007, (4): 103-109.

[7] 黎继烈, 励建荣, 李忠海, 等. 超声波辅助提取花生白藜芦醇工艺研究[J]. 中国粮油学报, 2009, 24(6): 119-122.

Li J L, Li J R, Li Z H, et al. Ultrasonic extraction of resveratrol from peanut[J]. Journal of the Chinese Gereals and Oils Association, 2009, 24(6): 119-122.

[8] 刘大川, 刘强, 吴波, 等. 花生红衣中白藜芦醇、原花色素提取工艺的研究[J]. 食品科学, 2005, 26(7): 144-148.

Liu D C, Liu Q, Wu B, et al. Research on extraction technology of resveratrol and procyanidin from red skin of peanut[J]. Food Science, 2005, 26(7): 144-148.

[9] 张建超, 高新周, 易德亮. 虎杖中白藜芦醇苷提取分离工艺研究[J]. 时珍国医国药, 2003, 14(4): 29-31.

Zhang J C, Gao X Z, Yi D L. Study on extraction process of polydatin inpolygonumcuspidatum[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2003, 14(4): 29-31.

[10] 陈易彬, 孙宝祥, 陈佳希. 虎杖中白藜芦醇的稳定性研究[J]. 中药材, 2007, 30(7): 805-807.

Chen Y B, Sun B X, Chen J X. Study on the stability of resveratrol in Rhizoma Polygoni Cuspidati[J]. Journal o f Chinese Medicinal Materials, 2007, 30(7): 805-807.

[11] 陈雷, 韩雅珊. 葡萄不同品种和组织白藜芦醇含量的差异[J]. 园艺学报, 1999, 26(2): 25-29.

Chen L, Han Y S. Studies on the content of resveratrol in different cultivars and organs of grape[J]. Acta Horticulturae Sinica, 1999, 26(2): 25-29.

[12] 刘竹兰, 张楠, 崔哲, 等. 紫外光对葡萄皮中白藜芦醇的诱导作用[J]. 食品科学, 2008, 29(5): 142-144

Liu Z L, Zhang N, Cui Z, et al. Effects of UV light on induction of resveratrol in grape peelings[J]. Food Science, 2008, 29(5): 142-144

[13] 冀剑霜, 张美玲, 钱伟斌, 等. 葡萄原料对干红葡萄酒品质及白藜芦醇含量的影响[J]. 中国酿造, 2010(11): 149-152.

Ji J S, Zhang M L, Qian W B, et al. Effects of grapes on the quality and resveratrol content of dry red wine[J]. China Brewing, 2010(11): 149-152.

[14] 刘仁旺, 滕增辉, 张邦乐, 等. 虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取及含量测定[J]. 第四军医大学学报, 2008, 29(3): 197-199.

Liu R W, Teng Z H, Zhang B L, et al. Extraction of resveratrol and polydatin from giant knotweed rhizome and its determination[J]. Journal of Fourth Military Medical University, 2008, 29(3): 197-199.

[15] Huang X, Mazza G. Simultaneous analysis of serotonin, melatonin, piceid and resveratrol in fruits using liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2011, 1218(2): 3890-3899.

[16] Benova B, Adam M, Pavlikova P, et al. Supercritical fluid extraction of piceid, resveratrol and emodin from Japanese knotweed[J]. The Journal of Supercritical Fluids, 2010, 51(3): 325-330.

[17] Sales J M, Resurreccion A V A. Maximising resveratrol and piceid contents in UV and ultrasoundtreated peanuts[J]. Food Chemistry, 2009, 117(4): 674-680.

[18] 张磊, 孙奎香, 孙庆杰, 等. 反相高效液相色谱法测定不同品种花生白藜芦醇含量[J]. 粮食与油脂, 2012(2): 33-34.

Zhang L, Sun K X, Sun Q J, et al. Determination of resveratrol in different peanut species by RP-HPLC[J]. Cereals & Oils, 2012(2): 33-34.