β—catenin蛋白敲除对肺成纤维细胞活性影响的实验研究

张亚娟++++++田新瑞++++++常+++琴++++++王崇刚++++++董艳婷

[摘要] 目的 探讨β-catenin蛋白敲除对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞（CCC-REPF-1）活性的影响及其机制。方法 体外培养大鼠肺成纤维细胞（CCC-REPF-1），应用CCK-8法、Western blot、 RT-PCR技术检测细胞增殖、活性及功能表达，进行统计学检验。 结果 TGF-β1刺激组、 pcDNA3转染组CCK-8吸光度OD值、α-SMA和Fn 蛋白表达量、α-SMA 、colⅠ、colⅢmRNA表达量明显高于正常细胞组，而E-cadherin蛋白表达量明显低于正常细胞组；F-TrCP-Ecad转染组上述值明显低于TGF-β1刺激组（P<0.01），E-cadherin蛋白表达量高于TGF-β1刺激组 （P<0.01）；TGF-β1刺激组、 pcDNA3转染组比较无明显差异。 结论 TGF-β1是促进肺成纤维细胞增殖、活化的重要细胞因子，β-catenin途径是TGF-β1 发挥作用的重要信号通路，β-catenin蛋白敲除通过阻断该信号途径，阻止肺纤维化进程。

[关键词] β-catenin；TGF-β1；肺成纤维细胞；肺纤维化

[中图分类号] R563.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）21-0001-04

肺纤维化是呼吸系统疾病发展至晚期的共同病理改变，造成肺功能不可逆的损伤，严重危害人类健康[1]。目前研究认为，肺纤维化的基本病理过程包括早期弥漫性肺泡炎及后期大量间质细胞增生，发生基质胶原的进行性积聚以致逐渐取代正常的肺组织结构，严重影响肺的通气和换气功能[2-3]。在增生的细胞中，除肺泡上皮细胞和成肌细胞等外，成纤维细胞的增殖及活化并分泌基质胶原是纤维化形成的重要机制[4]。TGF-β1被认为是诱导肺成纤维细胞活化的最重要的细胞因子[5]，其作用的发挥与β-catenin途径高度相关[6]。本研究通过观察β-catenin蛋白敲除对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的增殖及活性的影响，探讨β-catenin蛋白敲除抗肺纤维化作用的细胞机制，为肺纤维化的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及物品

大鼠肺成纤维细胞（CCC-REPF-1），pcDNA3.0载体（Invitrogen），F-TrCP-Ecad载体（郑国平教授惠赠），Lipofectamine2000（Invitrogen），TGF-β1（PeproTech），抗E-cadherin，抗α -SMA，抗Fn（ SantaCruz），FITC标志的羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物工程有限公司），胎牛血清（中国杭州四季青），高糖DMEM培养基（GIBCO），TRIzol总RNA提取试剂（武汉博士德生物工程有限公司），逆转录试剂盒（Promega），实时荧光定量试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），α-SMA引物、colⅠ引物、colⅢ引物、GAPDH引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。

1.2 肺成纤维细胞培养、传代及分组

在体外培养的大鼠肺成纤维细胞（CCC-REPF-1），用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基培养于5%的CO2，37℃人工培养箱中，细胞呈贴壁生长，进行传代培养。细胞分组，分为正常细胞组（A组）、TGF-β1刺激组（B组）、pcDNA3转染组（C组）、F-TrCP-Ecad转染组（D组）。

1.3 pcDNA3及F-TrCP-Ecad转染CCC-REPF-1细胞

提取及纯化重组质粒DNA，测DNA 浓度备用。取对数期细胞消化，调整细胞数为2×105 cells/L，接种12孔板中，观察细胞生长至80%～90%时，弃培液，换无血清无双抗培养基800 μL，准备转染。100 μL无双抗、胎牛血清的培养基中加入4 ng 质粒，混合后置5 min，共6个EP管，3管为质粒pcDNA3，3管为质粒F-TrCP-Ecad，100 μL无双抗、胎牛血清的培养基中加入 4 μL Lipofectamine2000混合后置 5 min，6个EP管，将上述复合物混合后置20 min，弃12孔板6孔的培养基，用无双抗、胎牛血清的培养基清洗2次，加无双抗、胎牛血清的培养基800 μL，将上述复合物分别加入 6个孔，前后晃置4～6 h换正常培养基。转染6 h换新鲜培养基，各组分别加入TGF-β1（5 ng/mL），作用48 h。

1.4 CCK-8法检测肺成纤维细胞增殖

将各组细胞调整细胞浓度至5000个/100 μL， 以每孔100 μL接种于96孔板，每组复设8孔，每板每孔加入CCK-8 10 μL，5%CO2孵育箱内继续孵育1 h，分光光度计下测定450 nm波长处OD值。

1.5 Western 印迹检测细胞中E-cadherin、α-SMA、Fn的表达

取细胞用PBS洗涤后转移到EP管，离心后弃上清，将收集到的细胞加细胞裂解液裂解1 h后，离心30 min，取上清，BCA蛋白质定量法测定蛋白浓度，取等量蛋白30 μL行SDS-PVDF凝胶电泳，转膜至PVDF膜，条件4 ℃ 2～5 h，5%脱脂牛奶封闭2 h。在4 ℃下小鼠抗大鼠E钙黏蛋白、α-SMA、纤维连接蛋白单克隆抗体（稀释为1∶200）与膜接触孵育过夜，用洗膜缓冲液（TBST）在脱色摇床下洗膜5 min×5次，加羊抗小鼠IgG，室温下孵育2 h后，TBST洗膜，加入ECL在室温下反应5 min后成像，Taiphone扫描结果，采用Gene Snap/Gene Tool软件分析以GAPDH蛋白为内参定量分析E钙黏蛋白、α-SMA、纤维连接蛋白条带相对灰度值。

1.6 总RNA 抽提及实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（Real-timePCR）endprint

各组细胞每孔加入500 μL TRIzol Reagent，按试剂盒说明提取总RNA及行RT-PCR检测α-SMA、colⅠ、col Ⅲ表达，GAPDH为内参。

GAPDH引物序列：上游引物5ˊ- GGTGCTGAGTATGTCGTGGAGT -3ˊ下游引物5ˊ- CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT -3，α -SMA上游引物5ˊ- AGCCAGTCGCCATCAGGAAC -3ˊ下游引物5ˊ- GGGAGCATCATCCCAGCAA-3ˊ，colⅠ：上游引物 5ˊ- GACATGTTCAGCTTTGTGTACCTC -3ˊ下游引物5ˊ- GGGACCCTTAGGCCATTGTGA -3ˊcol Ⅲ：上游引物5ˊ- TTTGGCACAGCAGTCCAATGTA -3ˊ下游引物5ˊ- GACAGATCCCGAGTTCGCAGA -3ˊ。PCR 反应体系条件： 95℃ 20 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s。40个循环。由随机附带软件计算出Ct值和拷贝数。

1.7 统计学方法

计量资料采用均数±标准差表示，数据处理采用SPSS 19.0软件进行t检验或方差分析，P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 肺成纤维细胞光镜下观察

成纤维细胞呈梭型，有较长的突起，胞核呈卵圆形，位于细胞中央，成放射状和栅栏状排列。TGF-β1刺激后，细胞体积明显增大，胞突消失，细胞数量明显增多，细胞间隙变小。F-TrCP-Ecad转染组大部分细胞呈梭型，有较长的突起，细胞间有明显间隙。见图1。

A 正常细胞（倒置相差显微镜×200）

B TGF-β1 刺激组（倒置相差显微镜×200）

C pcDNA3转染组（倒置相差显微镜×200）

D F-TrCP-Ecad转染组（倒置相差显微镜×200）

图1 肺成纤维细胞光镜下观察（×200）

2.2 CCK-8法观察各组肺成纤维细胞增殖

与正常组比较， TGF-β1刺激组、pcDNA3转染组其OD值明显增高，但两组比较，无统计学差异；F-TrCP-Ecad转染组OD值较TGF-β1刺激组明显减低（P<0.01），与正常组比较无统计学差异。见表1。

表1 CCK-8法测量各组大鼠肺成纤维细胞增殖OD值（x±s，n=8）

注：与正常组相比，aP<0.01；与F-TrCP-Ecad转染组相比，bP<0.01；与TGF-β1 刺激组相比，cP<0.01；与pcDNA3转染组比较，dP<0.01

2.3 Western印迹法检测各组细胞中α-SMA、Fn、E-cadherin的表达

与正常组比较， TGF-β1刺激组、pcDNA3转染组其α -SMA、Fn 蛋白表达显著升高， E-cadherin表达显著降低（P<0.01），而两组比较无统计学差异；F-TrCP-Ecad转染组较TGF-β1刺激组α -SMA、Fn 蛋白表达显著降低，E-cadherin表达显著升高（P<0.01），与正常组比较无统计学差异。见表2。

表2 各组大鼠肺组织中α-SMA、Fn 、E-cadherin蛋白表达（x±s，n=8）

注：与正常组相比，aP<0.01；与F-TrCP-Ecad转染组相比，bP<0.01；与TGF-β1 刺激组相比，cP<0.01；与pcDNA3转染组比较，dP<0.01

2.4 荧光实时定量RT-PCR检测α-SMA、colⅠ、colⅢ表达

与正常组比较， TGF-β1刺激组、pcDNA3转染组β-catenin途径α -SMA，colⅠ，colⅢmRNA表达增高（P<0.01），而两组比较无统计学差异，F-TrCP-Ecad转染组较TGF-β1刺激组α-SMA、colⅠ、colⅢ表达降低（P<0.01），与正常组比较无统计学差异。见表3。

表3 各组细胞α-SMA 、colⅠ、col Ⅲ mRNA相对表达量比较

（x±s，n=8）

注：与正常组相比，aP<0.01；与F-TrCP-Ecad转染组相比，bP<0.01；与TGF-β1 刺激组相比，cP<0.01；与pcDNA3转染组比较，dP<0.01

3 讨论

肺成纤维细胞增殖与活性增强是肺纤维化发生的重要的致病过程，对其机制的研究并寻找新的治疗靶点是目前研究的焦点[7]。肺纤维化过程中在TGF-β1刺激下[8]使肺成纤维细胞不断地增殖和转型为肌成纤维细胞（myofibroblast，MB）。MB是一种特殊阶段的FB，能够大量分泌ECM，分泌能力是FB 的4～5倍，大量表达α-SMA、Fn、I、III型胶原，加速纤维化进程。

TGF-β1是诱导肺成纤维细胞活化发生的最重要的生长因子[9]，TGF-β1发挥作用的途径包括Smad、β-catenin和非Smad通路，其β-catenin途径与疾病及纤维化形成的病理过程高度相关[8]。Vuga，et al[10]发现WNT5A基因途径在IPF的肺成纤维细胞较正常肺成纤维细胞有显著地调节意义，通过非经典的WNT/β-catenin途径[11-13]WNT5A激活显著地诱导肺成纤维细胞增殖同时抑制细胞凋亡。Chilosi等[14]报道了在特发性肺纤维化（IPF）患者受损支气管基底细胞和损伤部位肺成纤维细胞中可见β-catenin向细胞核内转移、积聚，提示β-catenin与肺纤维化及肺成纤维细胞活性的相关性，因此我们设想通过抑制β-catenin功能可能对肺纤维化发挥治疗作用。

F-TrCP-Ecad质粒是Cong[15]等设计的β-catenin靶向降解质粒，只降解细胞质中的β-catenin蛋白，而不破坏细胞膜上的β-catenin蛋白，从而减少其向细胞核内的转移，降低其转录活性。本研究采用该载体转染大鼠成纤维细胞，观察阻断β-catenin途径对肺成纤维细胞增殖及活性的影响。结果显示：TGF-β1刺激48 h后，成纤维细胞体积明显增大，胞突消失，细胞数量明显增多，细胞间隙变小，F-TrCP-Ecad转染组大部分细胞呈梭型，有较长的突起，细胞间有明显间隙。CCK-8法检测F-TrCP-Ecad转染组肺成纤维细胞增殖较TGF-β1刺激组明显降低。F-TrCP-Ecad转染组肺成纤维细胞间质细胞标志物α -SMA、Fn蛋白表达量明显低于TGF-β1刺激组，E-cadherin表达量较TGF-β1刺激组增高。F-TrCP-Ecad转染组大鼠肺成纤维细胞β-catenin途径转录产物α-SMA、colⅠ、colⅢ表达明显降低，证实β-catenin蛋白敲除通过降解细胞质中的β-catenin蛋白，减少其向细胞核内的转移抑制TGF-β1 诱导的肺成纤维细胞增殖、活性增强，抑制纤维化进程。endprint

综上所述，TGF-β1是促进肺成纤维细胞增殖、活化的重要细胞因子，β-catenin途径是TGF-β1 发挥作用的重要信号通路，β-catenin蛋白敲除载体（F-TrCP-Ecad质粒）通过阻断该信号途径，阻断成纤维细胞转化为其活性形式肌成纤维细胞，同时抑制成纤维细胞释放胞外基质，阻断纤维化进程，从而能为肺纤维化疾病治疗提供新的思路及实验依据。

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（收稿日期：2014-04-01）endprint