黄花棘豆不同生长时期苦马豆素含量的分析

马兰波，周青平，纪亚君，颜红波，刘文辉，丁成翔

(1.青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016； 2.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041)

黄花棘豆不同生长时期苦马豆素含量的分析

马兰波1，周青平2，纪亚君1，颜红波1，刘文辉1，丁成翔1

(1.青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016； 2.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041)

采用气相色谱法对黄花棘豆(Oxytropisochrocephala)不同生育期的根、茎、叶、花、果实及地上部分全草中主要有毒成分苦马豆素的含量进行检测，分析苦马豆素的变化规律，调查并计算单位面积黄花棘豆地上全草中苦马豆素的产量。结果表明，黄花棘豆果实中苦马豆素含量最高，达到107.787 mg·kg-1；地上部分全草中苦马豆素含量在结果期最高，达到48.19 mg·kg-1。从4个生长时期黄花棘豆不同部位苦马豆素含量平均值来看，果实>花>叶>茎>根；从地上部分全草中苦马豆素含量来看，结实期>盛花期>枯萎期>孕蕾期，样地中黄花棘豆地上部分全草苦马豆素产量也符合此规律。

黄花棘豆；苦马豆素；动态变化

棘豆属与黄芪属植物因含有有毒生物碱——苦马豆素(Swainsonine，SW)，被统称为疯草。黄花棘豆(Oxytropisochrocephala)是青海省天然草地常见的疯草类有毒植物之一，被各类家畜采食后会引起慢性中毒。曹光荣等[1]在黄花棘豆中提取出有毒生物碱，并认为其主要有毒成分为苦马豆素。苦马豆素中毒主要是因为苦马豆素阳离子与甘露糖苷酶具很高的亲和性，并且酸性α-甘露糖酶的最适pH是4.0，有利于弱碱性的苦马豆素分子离子化并快速渗入到酸性α-甘露糖苷酶作用区域与之结合，从而抑制酶功能，造成甘露糖累积，阻碍糖蛋白合成，大量低聚糖在溶酶体内聚集，神经细胞出现空泡变性，使家畜实质器官细胞和中枢神经系统都受到损害[2]。国内外大量研究表明，苦马豆素的含量直接影响着疯草毒性的大小[3]。由于棘豆属植物繁殖力强，生长迅速，而且蔓延速度较快，又含有有毒生物碱，不仅抑制其他牧草的生长，而且部分种类还会因为含有苦马豆素而导致各类家畜健康状况下降，甚至死亡；同时，苦马豆素又具有抗癌作用。研究表明，苦马豆素能有效逆转致死性辐照或高剂量化疗所造成的骨髓抑制，有望成为新世纪治疗癌症的克星[4]，所以近年来对疯草的研究已成为热点，人们一方面寻找有效措施对疯草进行脱毒处理，用于冬春季节牲畜补饲，提高疯草的利用率，另一方面研究苦马豆素提取工艺、生化特性、药用抑瘤机理，为创制抗癌新药物开辟新天地。疯草中苦马豆素含量因种类、分布部位、生长时期、生长环境等因素而有所不同，本研究拟通过气相色谱法，对黄花棘豆不同生长时期、不同组织的苦马豆素含量进行检测，以研究不同生长时期、不同组织苦马豆素的变化规律，为黄花棘豆合理利用及家畜中毒病防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1样品采集

黄花棘豆孕蕾期、盛花期、结果期、枯萎期样品，分别于2013年7、8、9、10月采集于青海省海北州刚察县公共马村，地理坐标为37°19′―37°29′ N，100°28′―100°32′ E，海拔3 405～3 569 m。土壤类型为栗钙土，草地类型为高寒草甸，样品阴干后，粉碎备用。在每个采样期，分别设置5块1 m×1 m的样方，调查黄花棘豆的高度、盖度及地上生物量。

1.2主要试剂

甲醇(AR，烟台市双双化工有限公司)，氯仿(AR，烟台市双双化工有限公司)，正丁醇(AR,solarbio)，吡啶(AR，上海中秦化学试剂有限公司)，苦马豆素标准品(纯度≥98%，美国EZNO)，双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)(上海伊卡生物技术有限公司)∶三甲基氯硅烷(TMCS)(solarbio)=99∶1(硅烷化试剂)。

1.3主要仪器

电子天平(BS 224 S，赛多利斯科学仪器有限公司)，超声波清洗器(SB-120DT，宁波新芝生物科技股份有限公司)，气相色谱仪(Agilent Technologies 7890A，安捷伦科技有限公司)，其他常规器材。

1.4标准曲线的绘制

[5]中标准曲线的绘制方法。准确称取SW标准品3.0 mg 于1 000 μL吡啶中，充分摇匀，即为SW 标准品贮备液。精密吸取200 μL SW标准品贮备液至1.5 mL 离心管里，再取5支1.5 mL 离心管分别加100 μL吡啶，按倍比稀释的方法配置成3.00、1.50、0.750、0.375、0.188、0.094 mg·mL-16个质量浓度梯度的溶液。分别按体积比5∶2加入硅烷化试剂，混匀后静置20～40 min后，进行气相色谱检测。色谱条件:AT.SE-54型毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱温210 ℃，进样口温度300 ℃，氢火焰离子化检测器(FID)温度280 ℃，流速为2 mL·min-1，进样1 μL，分流比为30∶1，载气为高纯氮气，载气压力200 kPa。以苦马豆素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制苦马豆素浓度-峰面积标准曲线图，并计算线性回归方程。

1.5黄花棘豆样品前处理

准确称取不同生长时期的根、茎、叶、花、果及地上部分样品各10 g，加入50 mL甲醇，超声协助提取两次，每次30 min，收集提取液合并挥干后，总浸膏用1 mol·L-1HCl完全溶解后，氯仿萃取除杂，酸水液经10% NaOH溶液调节pH为9～10后，再用正丁醇萃取5～8次，合并挥干，得粗生物碱部分。

1.6苦马豆素含量测定与计算

前处理得到的正丁醇部分用吡啶超声协助溶解，吡啶溶液按体积比5∶2加入硅烷化试剂，混匀后静置20～40 min后进行气相色谱检测。色谱条件同1.4。根据苦马豆素浓度-峰面积线性回归方程，计算出吡啶溶液中苦马豆素的浓度，再推算出植物中苦马豆素的含量(mg·kg-1)。

X=c×s×b×100.

式中，c表示根据线性回归方程得出的苦马豆素浓度(mg·mL-1)；s表示加入硅烷化试剂对吡啶溶液的稀释倍数；b表示吡啶体积(mL)。

1.7数据分析

采用Excel软件对数据进行整理，采用SPSS 17.0软件分别对不同生长时期相同组织、相同生长时期不同组织的苦马豆素含量进行单因素方差分析，并用Duncan法对各测定数据进行多重比较。

2 结果

2.1标准曲线的绘制

通过对6个浓度梯度的苦马豆素标准品进行气相测定，并对苦马豆素标准品浓度(x)、峰面积(y)进行线性回归分析，得如下回归方程：y=320.587 81x-10.793 06，R2=0.999 3，这表明，当苦马豆素进样质量浓度处于0.094～3.0 mg·mL-1时，苦马豆素质量浓度与峰面积比值线性关系良好。苦马豆素标准品气相色谱图如图1所示。

图1 苦马豆素标准品气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of standard SW

2.2黄花棘豆不同生长时期各组织苦马豆素含量测定结果

所有被测样品中，黄花棘豆果实中的苦马豆素含量最高，达到107.787mg·kg-1(表1)。不同组织中，在孕蕾期，叶中苦马豆素含量极显著高于根和茎(P<0.01)；盛花期的根、茎、叶、花中苦马豆素含量均差异极显著，以花中苦马豆素含量最高，达到28.438 mg·kg-1，根中最低；结实期，果实中苦马豆素含量最高，其次是叶、茎、根，叶和茎中苦马豆素含量未有极显著差异(P>0.01)；枯萎期，叶中苦马豆素含量最高，其次是果实和茎，二者间苦马豆素含量未达到极显著差异，根中苦马豆素含量最低。不同生长时期之间，根和茎中在苦马豆素含量都达到极显著差异，并且都以盛花期含量最高；叶中苦马豆素含量在结实期最高。

地上部分全草苦马豆素含量在结果期最高，达到48.190 mg·kg-1(图2)，极显著高于孕蕾期、盛花期和枯萎期(P<0.01)，孕蕾期最低，极显著低于其他所有生长期。

2.3样方调查结果及苦马豆素产量

各时期黄花棘豆平均株高、盖度、地上生物量的调查结果(表2)表明，地上干重在结实期最高，为39.32 g·m-2，样方内黄花棘豆地上部分全草苦马豆素产量为1.894 8 mg·m-2。样方内，黄花棘豆地上部分全草苦马豆素产量表现为结实期>盛花期>枯萎期>孕蕾期。株高、地上生物量和地上部分全草苦马豆素产量在盛花期、结实期和孕蕾期之间均达到极显著差异(P<0.01)，盖度在结实期、盛花期和孕蕾期之间有显著差异(P<0.05)。

3 讨论与结论

苦马豆素属于多羟基吲哚里西啶生物碱，在吲哚里西啶环上带有羟基，又称为吲哚里西啶三醇。生物碱的提取与检测方法有很多，如曹光荣等[6]提取方法是将两次浸泡过样品的酸水液通过强酸型离子交换树脂，蒸馏水洗至中性，用氨水调至碱性后，依次用氯仿、丙酮洗脱，分别浓缩，得到总生物碱，再经过硅胶柱层析，TLC 结合α-甘露甙酶活性抑制试验，分离出苦马豆素单体；刘志滨等[7]采用超声波协助提取，将水提液电炉加热浓缩，离心除杂，继续浓缩至一定体积后，调至碱性，分别用正丁醇和稀硫酸萃取，浓缩成膏状后，再用氨性氯仿萃取，浓缩萃取液，升华后得到苦马豆素，步骤较繁琐。苦马豆素的检测方法目前有薄层扫描法、高效液相色谱分析法、酶法和气相色谱法，各种方法都有其优缺点。本试验对苦马豆素的提取及检测采用赵兴华等[8]建立的方法，简化了操作步骤，方法稳定性好，精确度高。

表1 不同生长时期各部位苦马豆素含量Table 1 SW content in different parts at various stages mg·kg-1

注：同行不同大写字母表示相同部位不同生长时期差异极显著(P<0.01)，同列不同小写字母表示相同生长时期不同部位间差异极显著(P<0.01)。

Note:Different capital letters within the same row mean significant difference among different stages in the same part at 0.01 level，and different lower case letters within the same column mean significant difference among different parts at the same stage at 0.01 level.

图2 不同生长时期地上部分苦马豆素含量的变化Fig.2 Trend chart of SW on the abovegroundat various stages

注：不同大写字母表示不同生长时期间差异显著(P<0.01)。

Note:Different capital letter mean significant difference among different various stages of 0.01 level.

表2 不同生育期黄花棘豆测定结果Table 2 The investigation results and SW production

注：同列不同小写和大写字母分别表示不同生长时期在0.05和0.01水平上差异显著。

Note:Different lower case and capital letters within the same column mean significant difference among different stages at 0.05 and 0.01 level，respectively.

国外研究表明棘豆中苦马豆素含量大于0.001%水平就可造成家畜中毒[9]，国内对苦马豆素中毒剂量的研究表明，试验羊累计食入21.6～46.2 mg·kg-1苦马豆素会出现中毒[10-11]。黄花棘豆果实中的苦马豆素含量最高，达到107.787 mg·kg-1，花中苦马豆素含量达到28.438 mg·kg-1，这些植物部位被家畜采食一定量后足以引起中毒，地上部分全草中苦马豆素含量在结果期最高，达到48.19 mg·kg-1，相当于结实期25.43 m2草地上全部黄花棘豆干草中苦马豆素含量就可以引起家畜中毒，而孕蕾期和枯萎期的黄花棘豆苦马豆素含量虽较低，但如果长期采食，毒性物质也会在体内聚集，使动物出现中毒症状。不同种类、不同组织、不同生长时期的疯草苦马豆素含量都有所差别，王帅等[12]研究表明，小花棘豆(O.glabra)在结实期，果实中苦马豆素含量最高，为58.09 mg·kg-1。刘忠艳[5]对茎直黄芪(Astragalusstrictus)、变异黄芪(A.variabilis)等9种疯草的全草样品苦马豆素含量进行比较，其中甘肃棘豆(O.kansuensis)样品中含量最高，达到0.148‰。

苦马豆素属于植物次生代谢化合物，其含量受很多因素的影响，包括植物分布的海拔高度、土壤条件、天气条件以及周围分布的植物。Ralph等[13]对美国疯草蓝伯氏棘豆(O.lambertii)3个变种的苦马豆素含量进行了分析，推测该植物中苦马豆素含量的高度变异与植物的内生真菌有关。内生真菌菌丝体寄生在植物体的叶、茎、花、果实、种子等地上组织的细胞和细胞间隙，并且在种子中密度最高，主要分布在糊粉层和内皮薄壁层[14]，这就解释了果实中苦马豆素含量最高的原因。内生真菌与其寄主互利共生，一方面，寄主植物为内生真菌生长繁殖提供稳定的内环境，并通过种子帮其传播，另一方面，内生真菌代谢产物可以促进疯草生长发育，提高其抗逆性[15]。

黄花棘豆是青海草地上常见的疯草之一，生命力强，生物量大，资源丰富，通过对苦马豆素的不断深入研究，再对其合理利用，将会带来很大的经济效益。本试验结果表明，从4个生长时期不同组织苦马豆素含量平均值来看，果实>花>叶>茎>根；从地上部分全草中苦马豆素含量来看，结果期>盛花期>枯萎期>孕蕾期，样地中黄花棘豆地上部分全草苦马豆素产量也符合此规律。

参考文献

[1]曹光荣,李绍君,段得贤,刘乃利,马双民,党军海,周志明.黄花棘豆有毒成分的分析[J].中国兽医科技,1988,3:42-43.

[2]Dorling P R,Huxtable C R,Colegate S M.Inhibition of lysosomal α-mannosidase by swainsonine,an indolozidin alkaloid isolated fromSwainsonacanescens[J].Biochemical Journal,1980,191:649-651.

[3]刘忠艳,王占新,赵宝玉,路浩,马尧,孙莉莎,王吉荣.我国主要疯草苦马豆素动态规律研究[A].中国畜牧兽医学会家畜内科学分会2009年学术研讨会论文集[C].北京:中国畜牧兽医学会,2009:556-564.

[4]党朝晖,张梅.苦马豆素—抗癌新物质[N].陕西日报,2008-03-31(第4版).

[5]刘忠艳.茎直黄芪化学成分与疯草苦马豆素动态变化规律[D].杨凌:西北农林科技大学,2009.

[6]曹光荣,李绍君,段得贤,刘乃利,马双民,党军海,周志明,陈义忠,王定国,黑正祥,史长君.黄花棘豆有毒成分的分离与鉴定[J].西北农业大学学报,1989,17(3):1-6.

[7]刘志滨,赵兴华,余永涛,王建华.甘肃棘豆中苦马豆素提取工艺改进初报[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2006,34(1):96-99.

[8]赵兴华,崔忠华,耿果霞,王建华,张志敏,宋毓民,刘志滨.气相色谱-甲基化-α-D-甘露糖苷内标法测定变异黄芪中的苦马豆素[J].色谱,2007,25(5):781-782.

[9]Gardner D R,Molyneux R J,Ralphs M H.Analysis of swainsonine:Extraction methods,detection and measurement in populations of locoweeds(Oxytropisspp.)[J].Agricultural and Food Chemistry,2001,49:4573-4580.

[10]王凯,曹光荣,段得贤.黄花棘豆对山羊的毒性研究[J].畜牧兽医学报,1990,21(1):80-86.

[11]顾百群,段得贤,崔中林.山羊甘肃棘豆中毒临床病理学研究[J].西北农业大学学报,1990,18(3):62-68.

[12]王帅,陈根元,胡建军,马春晖.气相色谱内标法测定南疆地区小花棘豆中苦马豆素含量[J].新疆农业科学,2011,48(4):728-733.

[13]Ralphs M H,Creamer R,Baueom D.Relationship between the endophyteEmbellisiaspp.and the toxic alkaloid swainsonine in major locoweed species(AstragalusandOxytropis)[J].Biochemical Journal,2008,34:32-38.

[14]钱亚光,卢萍,牛艳芳,吕桂芬,陈立波,李鸿雁.含苦马豆素棘豆属植物及其内生真菌的研究进展[J].国际遗传学杂志,2010,33(4):162-166.

[15]周启武,白松,路浩,赵宝玉,陈基萍.疯草内生真菌研究现状与存在问题[J].草业科学,2012,29(7):1049-1057.

(责任编辑 王芳)

AnalysisofswainsoninecontentsatvariousstagesinOxytropisochrocephala

MA Lan-bo1, ZHOU Qing-ping2, JI Ya-jun1, YAN Hong-bo1,LIU Wen-hui1, DING Cheng-xiang1

(1.Academy of Animal Sciences and Veterinary of Qinghai University, Xining 810016, China;2.Institute of Qinghai-Tibet Plateau at Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

The main toxic swainsonine(SW) contents ofOxytropisochrocephalain various plant parts at different stages were detected by gas chromatography (GC),the dynamic regulation of swainsonine was analyzed, the SW production of the whole grass aboveground part inO.ochrocephalaper square metre was investigated and calculated.The results showed that the SW content of fruits was the highest, which was up to 107.787 mg·kg-1, the SW content in aboveground part at fruiting stage was the highest,which was up to 48.19 mg·kg-1.The averages of SW contents in different tissues at 4 period were pods>flowers>leaves>stems>root,the SW contents in aboveground part and the SW production of the whole grass aboveground part at four growth period were different which decreased in the following order: fruiting period>florescence period>withering period>bud formation period.

Oxytropisochrocephala; swainsonine; dynamics

ZHOU Qing-ping E-mail:qpingzh@aliyun.com

2013-12-11 接受日期：2014-05-20

棘豆型毒杂草退化草地的综合防治技术研究(美大项目2010)；青海省青藏高原优良牧草种质资源利用(2014-Z-Y12)；青海省青藏高原优良牧草种质资源研究(2014-Z-Y22)

马兰波(1988-)，女，甘肃徽县人，在读硕士生，主要从事牧草栽培育种研究。E-mail:mlbzzz@126.com

周青平(1962-)，男，甘肃宁县人，研究员，博导，博士，主要从事牧草栽培与育种研究。E-mail:qpingzh@aliyun.com

S452

：A

：1001-0629(2014)11-2164-05

10.11829j.issn.1001-0629.2013-0688