溶藻弧菌动物感染模型的建立及药敏试验分析

刘晓斐，张河林，胡志德，曹 源，胡成进

(济南军区总医院 实验诊断科，山东 济南250031)

溶藻弧菌是海洋弧菌科中数量最多的革兰氏阴性致病菌，广泛分布于世界各地海域和口岸处，易引起海洋作业人员伤口海水浸泡感染、中耳炎、眼内炎、胃肠炎、食物中毒和败血症等疾病[1-4]。由于其致病特点不同于陆地致病菌，其感染规律及致病机制尚不明确，感染后表型及代谢特征复杂多变导致了临床鉴定困难、不能及时救治等许多问题。溶藻弧菌感染主要发生在夏季，但随着全球变暖的趋势，溶藻弧菌感染的季节范围逐年扩大[4]。因此，海洋溶藻弧菌越来越受到人们关注。

到目前为止，海洋溶藻弧菌感染致病机制的研究模型多局限于海洋动物，如赤鲷[5]、鱼[6]、石斑鱼[7]、鲍鱼[8]等，而对于陆地哺乳动物感染研究较少，对于人类感染的研究仅停步在流行病学统计及病例报道，深入机制研究较少，并且可参考的动物感染模型甚少。因此，本实验建立了溶藻弧菌腹腔注射感染昆明小鼠模型，并对感染后小鼠尾血分离株进行抗菌药物敏感性分析，为临床上溶藻弧菌感染治疗中的合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株与实验动物

实验菌株：溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)菌株购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，菌种编号 E0666。

实验动物：SPF级雌性昆明小鼠6-8周龄，购于山东大学动物实验中心。

1.2 半数致死量测定

实验用健康昆明小鼠暂养2 d无异常情况后，进行腹腔注射感染。每组6只，共6组，分组饲养。细菌在含3%NaCl的碱性蛋白胨水中增菌16-20 h后收集菌悬液，将其浓度调整为4×1010、2×1010、1010、5×109、109cfu/ml，每个浓度腹腔注射菌液0.1 ml/只，对照组注射等体积无菌碱性蛋白胨水。观察24 h，并记录各组小鼠的死亡情况。

1.3 尾血培养

将小鼠固定在小鼠固定器上，露出尾部。将尾部放在50℃的热水中5分钟，待尾部充血后用干棉签擦干，再用75%酒精棉球擦拭小鼠尾部皮肤。待酒精蒸发后，用无菌剪刀剪去尾尖0.3 cm，拭去第一滴血之后取一滴血于无菌的3.0%NaCl碱性蛋白胨水中，置于37℃恒温摇床中145次/min过夜培养。

1.4 细菌鉴定

VITEK 2 Compact微生物自动鉴定仪(法国梅里埃公司产品)采用自动生化鉴定法，GN卡用于溶藻弧菌等革兰氏阴性菌。每个GN测试卡有64个反应孔，其内含有干燥培养基，将调配好的标准浓度菌悬液在充填机中被里面的负压充填到测试卡内，经封口后，放入测试槽内。读取器每15分钟判读卡片一次，测定卡片内细菌在各孔培养基内生长变化值，以生长动力学方式记录并决定结果，确保最佳报告结果时间。从平板上挑取单个菌落，用干燥无菌试管装3 ml无菌生理盐水在细菌比浊仪上配成0.5～0.62 MCF的菌悬液，按顺序放在卡架上，取出卡片后将吸管插入到试管中并固定在卡架上，放入填充窗。然后在VITEK 2 Compact微生物自动鉴定仪上按程序自动化完成填充、封口、上卡、卸卡，取出卡架，最后输入编号后保存。

1.5 药敏试验

采用纸片扩散法(K-B法)，药敏纸片为英 国 Oxiod公 司 产 品，实验条件为：MH 平板，菌落悬液为 0.5 麦氏单位，35℃恒温培养16-20 h，测量抑菌圈直径大小，再根据药敏试验抑菌圈直径数据和2012CLSI的M45规则判断对各种抗菌药物的敏感性。标准分为3个等级：敏感(S)、中度敏感(M)、耐药(R)。敏感和中度敏感可合称为敏感。质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923由本科室的临床微生物室提供。

2 结果

2.1 昆明小鼠感染后的一般情况

感染组注射溶藻弧菌菌液3 h后开始出现不同程度的毛发竖立、腹部颤抖、呼吸急促、背弓、蜷缩少动、进食减少等情况，症状的轻重与注射的菌量成正相关。对照组精神状态良好，无上述症状，无死亡。

2.2 半数致死量(LD50)

为筛选溶藻弧菌腹腔注射感染小鼠的最适菌量及感染时间，我们采用了半数致死量实验。结果如表1所示，当腹腔感染菌量为4×109cfu时，昆明小鼠死亡率为100%，平均存活时间为13.5 h。随着感染菌量的降低，小鼠死亡率也逐渐降低，存活时间延长。当感染菌量为109cfu时，小鼠死亡率降到50%。结果说明，溶藻弧菌E0666株感染昆明小鼠的半数致死量为109cfu，平均存活时间是20 h。

表1 溶藻弧菌E0666株腹腔注射感染昆明小鼠的半数致死量检测

2.3 小鼠尾血细菌培养及鉴定

为确定感染效果，我们在感染后2 h从4×109组中取小鼠尾血进行血液培养，37℃恒温摇床过夜培养后观察，如图1A所示,培养基浑浊，说明培养阳性。取少量培养液革兰氏染色后在油镜下观察形态如图1B所示，并经过VITEK2 Compact微生物自动鉴定仪鉴定为溶藻弧菌。结果说明，从尾血中分离出的溶藻弧菌来自于腹腔注射的溶藻弧菌，并且溶藻弧菌可以通过腹膜进入血液循环系统，导致菌血症或败血症。

A:尾血液体培养 B:细菌镜下形态

2.4 动物分离株药敏试验结果

为了评价溶藻弧菌对常用抗菌药物的敏感性，我们采用了纸片法，对溶藻弧菌动物分离株做了药敏指南上21种抗菌药物的敏感性实验，用精密游标卡尺准确量取药敏纸片周围透明抑菌环直径的大小，根据2012版的CLSI-M45来判断溶藻弧菌对抗生素的敏感性，三株质控菌株的药敏结果(抑菌环直径)都在质控范围内。实验结果表明，分离株对临床常用的大多数抗生素敏感，但对氨苄西林和头孢噻吩耐药，见表2。

表2 溶藻弧菌动物分离株对临床常用药物敏感性

†R：耐药；S：敏感

3 讨论

随着人们对海洋资源的开发和利用，海洋致病菌引起的疾病也随之引发人们关注。溶藻弧菌对于海洋生物的危害性早已得到共识，随着沿海地区散发临床病例报道，其对于人类的致病性也逐渐得到认同。目前，溶藻弧菌的致病机制研究仅限于海洋动物，缺乏对陆地哺乳动物的研究，并且尚无可用于研究的哺乳动物模型。致病性弧菌属中以霍乱、副溶血、创伤弧菌感染动物模型报道较多，多采用口服灌胃、创伤感染或腹腔注射等方式。因此，本实验首先建立了溶藻弧菌腹腔注射感染小鼠动物模型，得到溶藻弧菌E0666菌株的半数致死量为109cfu，平均存活时间为20 h。并且通过对尾血的细菌培养及镜下形态学观察、VITEK2 Compact微生物自动鉴定仪鉴定后确定了模型建立成功。该模型的建立对于研究溶藻弧菌的致病机制及疫苗预防等具有重要意义，为后续建立多种感染途径动物模型打下基础。

目前对于溶藻弧菌的药敏试验研究大多取自海水或海洋生物分离培养菌株[9]，细菌的致病性及代表性不强。本实验从感染小鼠的尾血中分离培养出动物适应株，对其抗生素敏感性进行检测。研究发现，该菌株对于临床上大多数抗生素敏感，但对氨苄西林和头孢噻吩耐药性很高。结果提示临床应注意用药，避免抗药性的产生和耐药菌株的传播。

总之，溶藻弧菌已成为我国沿海地区散发性腹泻和食物中毒的重要病原菌之一，对于驻岛人员和海上训练及作业人员具有潜在的致病危险。因此，开展海洋溶藻弧菌的致病机制研究和药敏试验研究对致病性弧菌所致疾病的防治具有重要意义。

作者简介：刘晓斐(1984-)，女，博士，主管技师，主要研究方向为重要病原菌的致病机制研究。

参考文献：

[1]Horii T,Morita M,Muramatsu H,et al.Antibiotic resistance in aeromonas hydrophila and vibrio alginolyticus isolated from a wound infection:a case report [J].J Trauma,2005,58(1):196.

[2]Ardic N,Ozyurt M.Case report:Otitis due to Vibrio alginolyticus[J].Mikrobiyol Bul,2004,38(1-2):145.

[3]Li XC,Xiang ZY,Xu XM,et al.Endophthalmitis caused by Vibrio alginolyticus [J].J Clin Microbiol,2009,47(10):3379.

[4]Sganga G,Cozza V,Spanu T,et al.Global climate change and wound care:case study of an off-season vibrio alginolyticus infection in a healthy man [J].Ostomy Wound Manage,2009,55(4):60.

[5]Ye J,Ma Y,Liu Q,et al.Regulation of Vibrio alginolyticus virulence by the LuxS quorum-sensing system [J].J Fish Dis,2008,31(3):161.

[6]Chen C,Wang QB,Liu ZH,et al.Characterization of role of the toxR gene in the physiology and pathogenicity of Vibrio alginolyticus [J].Antonie Van Leeuwenhoek,2012,101(2):281.

[7]Harikrishnan R,Balasundaram C,Heo MS.Poly d,l-lactide-co-glycolic acid-liposome encapsulated ODN on innate immunity in Epinephelus bruneus against Vibrio alginolyticus [J].Vet Immunol Immunopathol,2012,147(1-2):77.

[8]Wu CJ,Wang H,Chan YL,et al.Passive immune-protection of small abalone against Vibrio alginolyticus infection by anti-Vibrio IgY-encapsulated feed [J].Fish Shellfish Immunol,2011,30(4-5):1042.

[9]韩善桥，虞积耀，姜 涛，等.海水中致病性弧菌分离及抗菌药物敏感性分析 [J].中国抗生素杂志，2008，33(4):239.