促孕复方减毒增效研究*

李 靖 邓少荣 曾建武 刘亚萍 安淞麟 吴云霞△

1武警湖北总队医院急诊科，武汉 430060

2 华中科技大学同济医学院药学院湖北省天然药化与资源评价重点实验室，武汉 430030

中医药在治疗不孕症方面积累了深厚的理论基础和丰富的实践经验，其应用在体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transplantation，IVF-ET)技术中显示了良好的促着床效果。促孕复方(黄芪、黄芩、续断、白术)为课题组长期临床经验方，并经实验证实对超排卵(controlled ovarian stimulation，COS)刺激方案下小鼠的胚胎着床有良好的促进作用。本研究对促孕复方进行梯度极性系统的萃取和柱层析分离，最终得到活性部位成分DS-147[1-3]，运用COS着床障碍动物模型进一步筛选DS-147中各组分促着床活性，最终优化促孕复方达到减毒增效的作用。

1 材料与方法

1.1 药材

黄芪(RadixAstragaliMongolici，产地内蒙古)，续断(RadixDipsaci，产地四川)，白术(RhizomaAtractylodisMacrocephalae，产地浙江)，黄芩(RadixScutellariaeBaicalensis，产地内蒙古)，以上中药材均购于武汉江瀚大药房并经华中科技大学同济医学院药学院中药系汪建平博士鉴定。

1.2 主要试剂及实验药物

常用试剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；孕马血清(PMSG，宁波第二激素厂，批号：081020)；注射用绒毛膜促性腺激素(HCG，丽珠集团丽珠制药厂，批号：090103A)；硅胶(200-300目，青岛海洋化工厂)。

1.3 仪器

旋转蒸发仪(RE-5205，RE-52 AA型，上海亚荣生化仪器厂)；循环水式多用真空泵(SHB-ⅢS，郑州长城科工贸有限公司)；AG2 China万分之一天平(瑞士METTLER公司)；硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工厂)。

1.4 促孕复方活性部位DS-147的制备

1.4.1 促孕复方不同极性部位的制备 按复方配伍比例称取黄芪、续断、白术、黄芩中药饮片，第1次加10倍量60%乙醇(前期实验证实效果最好)，第2、3次依次用8、6倍量的60%乙醇各回流提取3 h，过滤后合并滤液，减压浓缩至2.0 L。取1.5 L浓缩液依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。各部位减压浓缩成为浸膏，再经冷冻干燥后成粉末备用。另0.5 L浓缩液经冷冻干燥后成粉末(促孕复方总提物)备用。见图1。

图1 萃取流程图

1.4.2 乙酸乙酯部位的硅胶柱层析分离

取乙酸乙酯部位干燥粉末30 g，用60 g硅胶拌好样后，加入到已静置好的硅胶柱中(样品∶硅胶=1∶10)，加好样品后样品层平整，无气泡。乙酸乙酯部位采用二氯甲烷和甲醇溶液从40∶1到1∶1梯度洗脱(以2个比例递减洗脱)，每个洗脱比例加入的溶剂量为4个柱体积，最终用甲醇冲洗剩余样品。洗脱样品经薄层鉴别合并共收集到了30个流分。见图2。

图2 柱层析图

据相关研究，促孕复方中黄酮类和皂苷类化合物具有促着床活性，因此本实验经过初步的化学成分鉴别反应，从30个流分中选择富含黄酮类或皂苷类的洗脱流分。方法是将收集的30个流分进行初步化学成分鉴别和TLC鉴别合并。分别取各组分溶液，按下列方法进行实验。黄酮类化合物的鉴别：①盐酸-镁粉反应；②三氯化铝反应；③碱性试剂显色反应。皂苷类化合物的鉴别：①醋酐-浓硫酸反应；②氯仿-浓硫酸反应；③泡沫反应。

经过初步的化学成分鉴别反应，从30个流分中筛选对黄酮类或皂苷类有阳性反应的洗脱流分(40∶1，38∶1，36∶1，28∶1，16∶1，12∶1，2∶1，1∶1洗脱部分)，用于后续的促着床药理活性筛选。筛选得到14个流分的混合物DS-147，促着床药物DS-147最终浓度为25 mg/ml，保存在4 ℃下备用。

1.5 COS着床障碍小鼠模型的建立

选用清洁级、健康昆明小鼠，雌性未交配过，雄性证明有生育能力，年龄8～12周，体重20～25 g，实验动物合格证号：SCXK(鄂)2010-0007(华中科技大学同济医学院实验动物学部)。雌、雄小鼠分笼饲养，自由饮食，自然光照，温度23～25 ℃，湿度40%～60%，当小鼠喂养至体重为(30±2) g后，进行正式实验。

采用联合注射PMSG和HCG的方法建立胚胎着床障碍小鼠模型，将喂养至体重为(30±2) g的小鼠，第1天17：00 pm注射PMSG 10 IU/只，48 h后注射HCG 10 IU/只，按雌雄比例1∶1合笼，次日8：00 am检查雌鼠阴道，发现有阴栓形成的为造模成功小鼠，计为妊娠第1天(PD1)。

1.6 DS-147中各组分促着床活性的研究

DS-147中包含有14个富含黄酮类或皂苷类的洗脱流分，为进一步验证DS-147中14组分是否为促着床必不可少组分，采用去一法和单一法对其活性进一步筛选确定。单一法为单独对DS-147中14个组分的促着床效果进行筛选，去一法为去掉DS-147中14组分的任一组分，来观察剩余组分组合的促着床效果。

将发现有阴栓形成的雌鼠，每组6只，随机分组，依次为COS模型组、黄体酮组、DS-147单一组分给药组和DS-147去一组分给药组。另取未经注射PMSG和HCG，自然交配形成阴栓的小鼠8只为正常对照组。正常组和模型组灌胃给予相应体积的生理盐水(20 ml/kg·d)，给药组依次灌胃给予相应药物。各组于妊娠PD1开始给药，连续给药8 d(PD1～PD8)。于妊娠PD8颈椎脱臼处死小鼠，剖腹，观察着床胚泡数(平均着床胚泡数=总着床胚泡数/孕鼠数)，并计算妊娠率[妊娠率=(孕鼠数/受试动物数)×100%]。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 促孕复方不同极性部位促着床效果观察

筛选结果表明促孕复方促着床最有效的部位为乙酸乙酯部位，乙酸乙酯中、高剂量组的妊娠率与模型组相比显著升高(P<0.05)。氯仿、正丁醇和水部位与模型组相比妊娠率也有一定程度提高，但差异无统计学意义(P>0.05)，且发现胚胎发育较小，效果较促孕复方组明显降低。见表1。

2.2 DS-147对COS小鼠的促着床作用观察

模型组妊娠率、平均着床点数和子宫重量较正常组均明显降低(P<0.01，P<0.01，P<0.001)；DS-147组和黄体酮组3项观察指标与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.001；P<0.01，P<0.05，P<0.001)；DS-147组和黄体酮组的各项指标差异无统计学意义。见表2。

表1 促孕复方及其不同极性部位促着床活性

表2 妊娠PD8妊娠率和平均着床点数的比较

2.3 DS-147中14组分单独促着床活性筛选

单一法和去一法各组分的给药剂量确定为200 mg/kg，与DS-147最佳剂量一致。在妊娠PD8观察给予不同组分的小鼠妊娠情况，发现DS-147中的单一组分对COS小鼠的妊娠率与模型组相比并没有显著差异，说明14个单独组分均不能单独提高小鼠的胚泡着床。DS-147中14个混合组分去掉其中的任何一个组分，COS后小鼠的妊娠率均显著下降。表明14个组分均对超排卵后小鼠的胚泡着床发挥着不可替代的作用，是通过协同作用发挥促着床效果。见图3-4。

与模型组比较*P<0.05

与模型组比较*P<0.05，** P <0.01，*** P<0.001

3 讨论

以IVF-ET为中心的辅助生殖技术近年来迅速发展，在临床得到了广泛的应用,然而ET后胚胎着床障碍依然是限制此项技术发展的瓶颈。因此,寻找提高COS后胚胎着床率的药物成为生殖领域的热点问题。控制性COS为IVF-ET的核心步骤，但COS被证明有明显降低内膜容受性、影响胚泡着床及影响妊娠结局的不利作用。目前国内外虽然建立了假孕及基因敲除着床障碍模型[4]，但这些模型均是阻断着床的某一关键分子或环节而阻断着床，不能模拟临床IVF-ET着床障碍的实际情况，使其临床应用受到限制。课题前期运用COS对着床的影响建立了有临床实际意义的小鼠COS着床障碍模型[5]，运用该模型建立筛选促进着床药物方法，筛选得到有效部位群组合物DS-147促进着床效果明显[6]，且未发现对正常妊娠有不良影响，使复方得以简化，去掉很多无效甚至毒性成分。本研究结果表明，通过恰当的模型(结合临床)，建立模型筛选方法，中药方剂可以进行优化和简化，药效可更强，而毒性并不增强。

促进胚胎生长、促进子宫发育、提高内膜容受性和抑制宫缩有利于胚胎着床，从而提高试管婴儿和反复着床失败妇女的妊娠率，促孕复方所用中药为2010药典所载且为临床妊娠常用较安全药材，方中首选黄芪为君药，黄芩当为要药，白术、续断为臣药。根据相关文献[7-9]报道，中药黄酮类和皂苷类化合物均具有促进胚胎着床作用。其中黄酮类提高胚胎着床成功率的机制可能是其对激素-免疫-炎症细胞因子及黏附分子网络系统联合作用的结果。皂苷类则能显著抑制子宫平滑肌自发收缩活动，降低其收缩幅度和张力，并对抗卵巢功能不足导致的流产作用。以上研究结果提示，若充分排除中药化学成分对患者和胎儿的毒性，以黄酮和皂苷类成分为主的中药有望成为治疗早产、流产的良药。因此本部分在乙酸乙酯促着床活性确定的基础上，采用硅胶柱分离部位成分，化学鉴别初步筛选出含有黄酮类或皂苷类成分的流分，进行后续的促着床药理活性筛选。最终筛选得到的活性部位成分DS-147中总黄酮、总皂苷和多糖不仅是其主要组分[1]，而且经实验验证是其活性组分。

对DS-147分离出的14个组分进行促着床药理活性筛选，本结果表明，14组分均不能单独发挥促进胚胎着床作用。且在14个混合组分DS-147中，去掉任一组分，促着床效果均下降或消失。实验结果提示，黄酮和皂苷各有效组分可能在相互促进相互抑制的基础上发挥各自的生理效应，从而达到一个更适合胚胎生长发育的成分配比和浓度，协同发挥促进胚胎着床作用。

本实验应用中药分离与药理活性筛选结合的方法，创新性地运用COS着床障碍模型及去一法与单一法结合筛选分离组分，确定了促孕复方促着床活性成分DS-147，其促着床活性较促孕复方原组方增强且未发现毒副作用。该研究为DS-147深入的化学成分和作用机制研究奠定了基础。

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