HPLC法测定结核病患者血浆中异烟肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的质量浓度

钱智磊，张 亮，周秋云，陆 磊，丁红梓，王 洁(南京市胸科医院药学部，南京 210029)

结核病(tuberculosis，TB)是严重危害人民群众健康的呼吸系统传染病，被列入我国法定重大传染病。近20余年来，多耐药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)及广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的流行，使得包括我国在内的各国抗痨事业再次面临严峻的挑战[1]。2011年，全球有63万人被确诊为MDR-TB，其中MDR-TB在初治及复治结核患者中的检出率分别为3.7%和20%。我国是27个MDR-TB流行国家中最严重的国家之一。此外，有84个国家已发现XDR-TB，占MDR-TB病例的9%[2]。

异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是用于结核病患者初始治疗的基本药物，大部分患者都可以得到良好的治疗效果。然而，越来越多的患者(包括初治及复治)对以上药物中的1种或多种耐药，使得结核病的治疗变得更加复杂，增加了病死率。WHO公布的耐药结核病规划管理指南(2011年版)指出，对于MDR-TB患者，推荐使用氟喹诺酮类和乙硫异烟胺[3]。目前，最有效的氟喹诺酮类药物的活性由强至弱依次是:莫西沙星>左氧氟沙星>氧氟沙星，考虑到经济因素，以选择左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)为宜。但是，临床有报道，大约有2%～5%结核患者按标准治疗方案和剂量给药，疗效仍然不理想甚至治疗失败，研究证实这些患者的血药质量浓度远低于普通病例平均血药质量浓度[4-5]；同时，传统的抗结核治疗药物易造成肝功能异常等不良反应[6]，导致治疗中断，进而影响患者的治疗。因此，临床对于这些病例进行血药质量浓度治疗监测成为必要，通过血药质量浓度的监测，可以较好地减少不良反应的发生，保证疗程的实施，提高治疗效果。本研究团队在长期进行结核病患者抗结核药物血药质量浓度监测的基础上[7-9]，进一步建立了同时测定结核病患者血浆中异烟肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的血药质量浓度的HPLC法，结果表明，本方法准确、快速、经济，适合临床推广。

1 仪器与试药

1.1仪器 高效液相色谱系统(液相泵LC-20AB，PDA紫外检测器SPD-M20A，岛津，日本)；高速离心机(TG1650-WS，上海卢湘仪)；艾本德微量移液器(Eppendor，德国)；电子分析天平(EB224，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；涡旋仪(WH-2，上海沪西分析仪器有限公司)。

1.2试药 异烟肼对照品(批号100578-200401)、吡嗪酰胺对照品(批号100178-200403)、利福平对照品(批号130496-200702)、左氧氟沙星对照品(批号130455-200202)，均为中国药品生物制品检定所提供；甲醇、乙腈(Merck公司，德国)均为色谱纯；磷酸二氢钾、三乙胺(国药集团化学试剂有限公司，中国)均为分析纯；水为自制纯化水(Milli-Q Academic，MILLIPORE公司，美国)。

2 方法

2.1色谱条件 色谱柱：岛津Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；检测波长：异烟肼261 nm、吡嗪酰胺268 nm、利福平340 nm、左氧氟沙星294 nm；流动相：A.甲醇，B.乙腈，C.0.05 mol·L-1KH2PO3水溶液(三乙胺调pH 6.0)，梯度条件(含次针预平衡时间)见表1；进样量：20 μL。

表1 异烟肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的HPLC梯度条件

2.2对照品溶液的配制 精密称取一定量的各对照品，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度分别为INH 1 000 μg·mL-1、PZA 1 000 μg·mL-1、RFP 1 000 μg·mL-1和LVFX 1 000 μg·mL-1的储备液。储备液于4 ℃冰箱保存。临用前以甲醇稀释成各种质量浓度的对照品溶液。

2.3样品处理方法 取血浆样品300 μL，置于2 mL离心管中，加甲醇700 μL，旋涡混合1 min，以15 000 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样。

2.4方法专属性实验 按2.3项下操作，同法处理人空白血浆、对照品溶液加空白血浆和同时服用4种药物患者血浆样品。INH(通道一261 nm)、PZA(通道二268 nm)、 RFP(通道三340 nm)、LVFX(通道四294 nm)。

2.5标准曲线制备 取空白血浆8份，加入对照品储备液使各对照品质量浓度为0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4，12.8和25.6 μg·mL-1。按2.3项下操作，同法处理血浆进样。以样品质量浓度为横坐标、以对照品的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，以样品质量浓度和峰面积进行回归计算。

2.6精密度与回收率 精确配制低，中，高(0.75，7.5和15 μg·mL-1)的含4种药物的血浆样品，按2.3项下操作，同法处理血浆进样。计算加样回收率、日内及日间精密度。

2.7重复性与稳定性

2.7.1重复性实验 取同一质量浓度的储备液，重复5次取样制备供试品溶液，测定，计算标准偏差。

2.7.2稳定性实验 取低、中、高(0.75，7.5和15 μg·mL-1)的血浆对照品样品，分别于0，1，2，4，8和12 h内测定，计算标准偏差。

3 结果

3.1方法专属性实验结果 4种药物分离的峰形良好，内源性物质无干扰，INH(通道一261 nm)、PZA(通道二268 nm)、RFP(通道三340 nm)、LVFX(通道四294 nm)的保留时间分别为4.7，5.6，12.6和13.9 min。见图1。

3.2标准曲线与线性范围结果 本方法线性关系良好，线性范围可以基本包括结核病患者的血药质量浓度范围。见表2。

表2 INF，PZA，RFP和LVFX的回归方程与线性范围

图1 HPLC图

3.3精密度与回收率结果 按2.6项下操作，各结果均符合规定。见表3。

表3 回收率与精密度测定结果

3.4重复性与稳定性结果 按2.7项下操作，结果重复性RSD为1.72%，稳定性RSD为1.69%，表明该方法的重复性及稳定性良好。

3.5患者血药质量浓度 选取同时口服4种药物5 d以上的患者5例，利福平0.45 g于早餐前30 min服用，异烟肼0.3 g和吡嗪酰胺0.5 g于餐后30 min服用，左氧氟沙星0.5 g于餐后60 min服用，用抗凝管采集病人服用异烟肼、吡嗪酰胺2 h后的静脉血，以10 000 r·min-1离心10 min，分取血浆，置于离心管中，保存于低温冰箱，备用。按 2.3项下操作，测定5名患者血药质量浓度，数据均在线性范围内，见表4。

表4 患者血药质量浓度测定结果

4 讨论

本课题组比较了液液萃取法、甲醇沉淀吹干复溶法、固相萃取法和本方法采用的甲醇沉淀上清液直接进样法，发现液-液萃取法的线性关系和精密度均不理想，而甲醇沉淀吹干复溶法需添加抗氧化剂，且耗时较长，不能满足临床报告需求。固相萃取法效果理想，但是成本较高，综合成本超过物价局收费规定，不适合医院常规开展检测工作。相对而言，甲醇沉淀上清液直接进样法减少了浓缩步骤；对方法灵敏度有影响，但是操作简单，平行性好，所需时间及成本均较少，便于临床开展。

目前报道的多组分抗结核药物的同时测定往往应用离子对试剂[10]，导致需要较长的柱平衡时间，且实验重复性较差。同时，离子对试剂价格较高，且对色谱柱的损害较大，导致成本偏高，不适合医院常规使用。本方法在流动相的选择上避免了应用离子对试剂，选择了常规缓冲盐体系，虽然在分离度方面略微低于离子对试剂，但仍然能够达到专属性实验的要求，降低了检测成本，有利于临床工作的常规开展。

在前期研究中本课题组对不同固定相的色谱柱进行了筛选[9]，本次研究在此基础上对色谱柱的柱长和填料粒径进行了考察。发现250 mm的色谱柱相对于150 mm的色谱柱而言，可以略延长保留时间，增加分离度，但总体无显著性差异，因此选择150 mm色谱柱可以提高效率，较适合临床常规检测工作。填料粒径3.5 μm的色谱柱与5 μm的色谱柱相比，可以增加分离度，改善峰形。但对于生物样品来说，往往杂质较多，且蛋白沉淀难以完全，易导致色谱柱污染，同时3.5 μm的色谱柱的价格远远高于5 μm的色谱柱，大大提高成本。综合以上特点，本课题组选择150 mm的填料粒径5 μm的色谱柱进行实验，为以后临床常规检测奠定基础。

本方法在15 min内可以完全出峰，考虑到生物药品的复杂性，因此本课题组在15 min后加入一段较长时间的冲洗与次针预平衡时间，从而保证次针检测的稳定性与准确性。

通过血药质量浓度监测，可以避免因个体差异导致的血药质量浓度过高所致的不良反应，同时可以避免血药质量浓度过低导致的疗效降低及耐药性的产生。

参考文献：

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[2] Global tuberculosis control 2011[EB/OL].http: //www.who.int / tb / publications /global_report /2011 / en /.

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[9] 钱智磊，周秋云，陆磊，等. HPLC法测定结核病患者血浆中异烟肼、吡嗪酰胺和利福平的质量浓度[J].西北药学杂志，2013，28(6): 611-614.

[10]Z F Zhou， L Y Chen， P Liu， et al. Simultaneous determination of isoniazid， pyrazinamide，rifampicin and acetylisoniazid in human plasma by high-performance liquid chromatography[J]. Anal Sci， 2010， 26(11): 1133-1138.