宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP基因及蛋白水平改变关系的研究

秦薇

[摘要] 目的 研究宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP基因及蛋白水平改变的关系。方法 以我院收治的70例宫颈癌患者为观察组，另选正常宫颈组织70例为对照组。分别对两组对象的宫颈组织进行DNA提取、总RNA提取、cDNA合成、PCR反应扩增。并检测HPV感染、Rap1GAP基因外显子E11和E19缺失率、Rap1GAP mRNA表达及Rap1GAP蛋白表达情况。 结果 观察组患者HPV感染明显高于对照组（P <0.05）。观察组HPV阳性和阴性组E11和E19的缺失率比较，差异无统计学意义（P >0.05）。Rap1GAP mRNA、Rap1GAP蛋白在观察组HPV阳性组组织中的表达率、阳性表达率明显低于HPV阴性组（P <0.05）。宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP mRNA的表达呈正相关（r=0.578），与Rap1GAP 蛋白的阳性表达呈正相关（r=0.554）。 结论 宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP mRNA的表达呈正相关，与Rap1GAP 蛋白的阳性表达呈正相关。

[关键词] 宫颈癌；HPV感染；Rap1GAP基因；Rap1GAP蛋白；关系

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）20-0037-04

在临床上，肿瘤一直是一种死亡率较高的病症，肿瘤疾病的发展过程，主要依靠一系列基因以及多阶段致癌，过程相对复杂，其发生机制主要是因为原癌基因被激活以及抑癌基因失活所致。在肿瘤疾病中，宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤疾病，是仅次于乳腺癌的肿瘤疾病，多发于发展中国家。而在近几年来，宫颈癌的发病群体日益扩大，年轻群体也存在着发病趋势。宫颈癌的发病诱因一般与多个因素影响有关，包括病毒感染、早婚早育、多产吸烟以及不良性行为等。Rap1GAP是近年来最新发现的与宫颈癌相关的抑制基因，其基因及蛋白水平的表达与宫颈癌组织HPV感染是否有关成为临床探讨的重要课题[1-8]。本文以我院2011年1月～2013年1月收治的70例宫颈癌患者为研究对象，探讨宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP基因及蛋白水平改变的关系，现报道如下。

1资料与方法

1.1临床资料

选择我院2011年1月～2013年1月收治的70例宫颈癌患者为观察组，所有患者均经手术病理证实为宫颈癌，年龄 28～65 岁，平均（45.4±5.4）岁。另选正常宫颈组织70例为对照组，年龄 27～63 岁，平均（46.7±6.3）岁。两组患者在年龄等一般资料的比较上，差异不存在统计学意义 ，具有可比性。

1.2试剂、仪器和方法

取两组对象的宫颈组织均分为2块，一块用10%甲醛予以固定，石蜡包埋。另一块速冻后置冰箱待检。

1.2.1主要试剂和仪器 主要试剂：RT-PCR 试剂盒、琼脂糖、Trizol试剂、DEPC、EB等；主要仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶图像分析系统、离心机、免疫组化对照系统等。

1.2.2方法 ①DNA的提取 根据试剂盒的操作说明，分别取两组的组织标本进行离心，洗脱DNA，于4℃温度下保存备用。②总RNA提取 分别取两组冷冻的组织标本离心处理，用DEPC水溶解RNA，采用凝胶成像系统对RNA的表达进行检测。③cDNA合成 根据试剂盒的操作说明，以提取的总RNA为模版，以随机引物做引物，进行cDNA合成。④引物设计 对Rap1GAP、β-actin及Rap1GAP的11号和19号外显子进行引物设计，引物设计方法见文献[2]。⑤PCR反应扩增 根据PCR仪的操作说明进行PCR反应扩增。⑥电泳及Rap1GAP mRNA表达 分别取两组3μL的Rap1GAP、β-actin的反应产物和Rap1GAPE11和E19的扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳[6]。采用凝胶图像分析系统对电泳结果进行分析，检测Rap1GAP mRNA的表达结果[7]。⑦HPV感染检测 采用免疫组织化学法分别对两组对象组织中的HPV感染进行检测。感染判定标准[8]：阳性：细胞浆或细胞核出血棕黄色颗粒，5个高倍视野观察下，HPV（+）为阳性细胞>30%[3]。⑧Rap1GAP蛋白的表达检测 将已知胃癌的组织切片作为Rap1GAP蛋白的阳性对照[4]。

1.3观察指标

①HPV感染情况；②观察组组织中Rap1GAP基因外显子E11和E19的检测结果；③观察组患者宫颈癌组织中Rap1GAP mRNA表达检测结果；④观察组患者宫颈癌组织中Rap1GAP蛋白表达检测结果。

1.4统计学方法

采用SPSSl0.0统计学软件，计量资料用（x±s）表示，组间比较应采用t检验，计数资料采用χ2检验，采用Spearman相关系数分析， P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 HPV感染情况

观察组70例患者中，53例患者HPV感染，HPV感染率为75.71%；对照组70例对象中，11例HPV感染，HPV感染率为15.71%。观察组患者HPV感染明显高于对照组（χ2=4.32，P<0.05）。

2.2 观察组组织中Rap1GAP基因外显子E11和E19的检测结果

观察组70例患者中，53例HPV阳性组E11和E19的缺失率均为7.55%；17例HPV阴性组E11和E19的缺失率均为11.76%。观察组HPV阳性和阴性组E11和E19的缺失率比较，差异无统计学意义（χ2=1.22，P>0.05）。因此，宫颈癌患者组织中Rap1GAP基因外显子E11和E19的缺失与HPV感染无明显相关性（r=0.816，P>0.05）。见表1。

表1 观察组组织中Rap1GAP基因外显子E11和E19的检测结果[n（%）]

2.3观察组患者宫颈癌组织中Rap1GAP mRNA表达检测结果endprint

观察组70例患者，其中53例HPV阳性组组织中Rap1GAP mRNA的表达率为0（0/53）；17例HPV阴性组组织中Rap1GAP mRNA的表达率为70.59%（12/17）。Rap1GAP mRNA在观察组HPV阳性组组织中的表达率明显低于HPV阴性组。因此，宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP mRNA的表达呈正相关（r=0.578）。

2.4观察组患者宫颈癌组织中Rap1GAP蛋白表达检测结果

观察组70例患者，其中53例HPV阳性组组织中Rap1GAP蛋白阳性的表达率为9.43%（5/53），17例HPV阴性组组织中Rap1GAP蛋白阳性的表达率为35.29%（6/17）。Rap1GAP蛋白在观察组HPV阳性组组织中的阳性表达率明显低于HPV阴性组。因此，宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP 蛋白的阳性表达呈正相关（r=0.554）。

3 讨论

目前，随着人们生活方式以及饮食结构的日益变化，宫颈癌的发生率也不断上升，对广大妇女的生活、工作以及学习造成了严重的影响。高危型HPV感染是宫颈癌中一个重要的因素。然而，HPV导致宫颈癌分子生物学的机制在目前尚不明确。相关研究显示，E6TP1在HPV感染的宫颈癌患者中，表达水平显著下降。因此猜测Rap1GAP与HPV感染在临床上存在密切的联系，与宫颈癌的发生发展的分子生物学机制有关[5]。

经过克隆鉴定，目前存在有100多种HPV，其中有30多种主要来源于受感染的生殖道组织的分离[6]。结合HPV的致病能力，可以将其划分为低危型以及高危型两种。其中低危型的HPV主要包括HPV-6、HPV-11、HPV-30、HPV-42、HPV-43以及HPV-44，可引起生殖道外生性扁平疵类病变以及低度宫颈上皮内瘤样病变，即CIN1级；而高危型HPV主要包括了HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58以及HPV-61，高危型HPV主要会引起高度宫颈上皮内瘤样病变以及宫颈癌，高危型HPV中主要以HPV-16以及HPV-18为主，在CIN以及浸润癌中比较常见[7]。

HPV作为一种肿瘤病毒，其体型较小，且细胞结构上不存在胞膜，存在双链闭环DNA基因组，长度为7900bp，编码蛋白主要包括了E1、E2、E3、E4、E5、E6、E77种[8]。在这些编码蛋白中，E6和E7与肿瘤恶化转化以及永生化有关。同时，E6和E7与细胞癌基因以及抑癌基因会相互作用，亦成为导致HPV致癌的一个关键点。E7蛋白一般存在于宿主细胞的细胞核内部，与肿瘤抑制基因Rb蛋白相互结合，对细胞周期的调节进行影响，同时还会干扰DNA的修复，导致细胞出现不稳定性[9]。而E6蛋白则主要位于宿主细胞的细胞膜以及细胞核内部，当E6与P53相互结合后，P53会对泛蛋白-蛋白酶体系统进行降解，从而使其丧失抑癌作用，引起细胞的增殖[10]。

宫颈HPV感染与患者的年龄存在联系，一般多发年龄段为15～25岁的群体，对于30岁以上以及绝经后的群体，HPV的感染率会减少，单一性伴侣的妇女，其HPV感染率也相对较低[11]。正常情况下，宫颈组织的HPV检出率为11%到37%，而宫颈癌的HPV检出率则为75%，可见，HPV在正常组织以及宫颈癌中均存在较高的感染率[12]。

随着分子生物学和分子流行病学的迅速发展，病毒感染与肿瘤的关系日益受到广泛重视。HPV是一种微小的DNA病毒，目前，相关临床研究证明，HPV感染是诱发宫颈癌的主要病因和必要条件[13]。Rap1GAP是近年来最新发现的与宫颈癌相关的抑制基因，是Rap1特异的GTP酶活化蛋白，通过对Rap1的催化，而使从有活性的GTP结合形式向无活性的GDP形式转变。而Rap1作为小分子G蛋白，在细胞的多种功能中发挥了参与作用，能够对细胞的增殖、分化进行调节[13]。因此，其活性的强弱与肿瘤的发生、发展密切相关。因此，Rap1GAP作为调控Rap1活性的媒介，其与肿瘤的发生发展也会有密切关系。因此，Rap1GAP是否像E6TP1一样参与了HPV的作用机制，进而影响宫颈癌的发生、发展是近年来临床医学研究的热点[14]。

相关临床研究报道[15，16]，通过酵母杂交技术发现HPV家族的中E6与Rap1GAP家族成员中的E6可相互作用，即在HPV感染的发生机制中，Rap1GAP家族成员中E6TP1羧基末端的40个氨基酸残基可与HPV家族的中E6相结合，且结合后会被泛素化，并在蛋白酶的作用下被降解，从而使Rap1的活性被激活，从而形成Rap1通路，导致肿瘤的形成[15]。因此，可以发现HPV感染的发生与Rap1GAP密切相关。同时，另有相关研究报道证实，Rap1GAP蛋白反过来会对Rap1起控制作用[16]。Rap1GAP的基因是ID（DNA结合的抑制因子）蛋白的一个直接目标。当存在ID蛋白时，Rap1GAP启动子被关闭，然而当ID蛋白缺乏时，可与ID蛋白相互作用的bHLH因子能够与Rap1GAP启动子相结合，并将其激活。且Id-Rap1GAP-Rap1信号通路在神经干细胞的维持更新中发挥了重要的作用。因此，Rap1GAP 蛋白在活的有机体中抑制了Rap1GAP表达，从而维持活化的Rap1，Rap1GAP蛋白的表达与Rap1GAP的活性呈现正相关。Rap1GAP含25个外显子，编码663个氨基酸，其GAP活性区在75～416个氨基酸之间，故本实验选择Rap1 GAP活性区域中的E11和E19来分析Rap1GAP在宫颈癌中的表达机制。PCR扩增Rap1GAP基因外显子E11和E19，正常宫颈组织中Ell和E19无缺失，宫颈癌中Ell及E19的检出率与正常宫颈组织的检出率无明显差异，表明Ell和E19在宫颈癌中无缺失。宫颈癌HPV阳性组E11及E19的缺失与HPV阴性组也无明显不同，因此，HPV感染与E11及E19在宫颈癌的缺失无相关。endprint