郑州市首例人感染H7N9禽流感病例的实验室检验分析

牛卫东　戴蕾　史军

【摘要】 目的：对郑州市首例人感染H7N9禽流感病例进行实验室诊断和分析，以提高实验室应急检测能力。方法：采集郑州市管城区1例疑似病例的鼻、咽拭子样本，提取病毒RNA，采用甲、乙型流感通用引物和探针、季节性流感（包括H1N1、H3N2）特异性引物和探针、甲型H1N1流感特异性引物和探针以及H5N1和H7N9特异性引物和探针，以Real-time RT-PCR方法检测流感病毒核酸。结果：乙型流感、季节性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感扩增结果均为阴性；甲型流感通用引物和H7N9亚型流感病毒扩增结果均为阳性。结论：样本经河南省疾控中心与国家疾控中心复核检测，证实该患者为郑州市首例人感染H7N9禽流感病例。

【关键词】 禽流感； H7N9； Real-time RT-PCR

自2013年2月起，我国上海和安徽等地先后出现不明原因重症肺炎病例，之后被确诊为人感染H7N9禽流感。此前报道的可感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3[1-3]。H7N9亚型主要在野生鸟类中间传播，在此之前无人感染病例。甲型流感病毒可以通过基因重组而改变其抗原性，人类历史上几次流感大流行的病毒株都是通过人类季节性流感病毒和动物流感病毒的基因重组而来[4-5]。人感染H7N9禽流感病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒[2]。人感染H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病，是一种新型呼吸道传染病。本文对郑州市首例人感染H7N9禽流感病例的实验室检验方法和过程进行了总结和分析，旨在进一步提高实验室对该类病例的应急检测能力，这对相关病例的早发现、早诊断、早隔离、早治疗，防止疫情扩散，降低病死率具有十分重要意义。

1 材料与方法

1.1 临床样本 患者王某，男，38岁，汉族，农民，从事活禽宰杀销售工作。患者自述4月8日出现畏寒、咽痛，自行服药治疗，病情未见好转，于4月11日上午前往乡卫生院就诊，初步诊断为“左下叶肺炎”。下午患者自行到郑州市某市级医院急诊科就诊，CT诊断报告为：左肺下叶炎症。患者以“肺炎”转至省传染病医院隔离排查。当晚，郑州市疾控中心实验室采集患者的鼻咽拭子样本进行Real-time RT-PCR检测，检验结果显示患者H7N9禽流感病毒核酸阴性，鉴于患者为禽类接触的高危人群，疾控机构持续关注患者病情变化。4月16日，省传染病医院报告该患者病情出现进行性加重，故市疾控中心再次采集患者鼻咽拭子和下呼吸道分泌物标本进行检测，4月17日初步检测结果为H7N9禽流感病毒核酸阳性。4月18日，省疾控中心复核检测阳性。经省级专家组会诊，判定为人感染H7N9禽流感病例。

1.2 检测试剂与仪器 病毒核酸提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；甲乙型流感、季节性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）均购自北京金豪制药股份有限公司；人感染H7N9禽流感病毒RNA检测使用的AM1005试剂盒（荧光PCR法）购自ABI公司；人感染H7N9禽流感特异性引物和探针由国家疾控中心下发；采用Real-time RT-PCR方法，运用Bio-Rad CFX96和Bio-Rad IQ5实时荧光定量PCR仪进行流感病毒核酸检测[6]。

1.3 引物和探针 由国家疾控中心下发的人感染H7N9禽流感特异性引物和探针序列见表1。

表1 人感染H7N9禽流感特异性引物和探针序列

引物和探针名称 序列（5-3）

CNIC-H7F AGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA

CNIC-H7R GGTTTTTTCTTGTATTTTTATATGACTTAG

CNIC-H7Probe1 FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1

CNIC-N9F TGGCAATGACACACACTAGTCAGT

CNIC-N9R ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT

CNIC-N9Probe1 FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1

1.4 检验方法与步骤

1.4.1 核酸提取 吸取5.6 ?L Carrier RNA至含560 ?L AVL的Eppendorf离心管中，吹打混匀。加200 ?L标本到上述离心管中，吹打混匀，安全柜内孵育10 min。加560 ?L无水乙醇（96%～100%）到离心管中，吹打混匀。吸取660 ?L溶液至Rnase-free吸附柱CR2中，盖上离心管帽，7000 rpm离心1 min弃掉套管。重复一次。加500 ?L缓冲液GD，盖上离心管帽，7000 rpm离心1 min，弃掉套管。加500 ?L漂洗液RW，盖上离心管帽，11 000 rpm离心3 min，弃掉套管。将吸附柱放入一个新的1.5 mL无RNA酶离心管中，打开吸附柱盖子，放置3 min，使吸附膜完全变干，加入70 ?L Rnase-free ddH2O，盖上盖子，孵育5 min，7000 rpm离心1 min，收集病毒RNA模板。

1.4.2 Real-time RT-PCR 人感染H7N9禽流感检测使用ABI公司的AM1005试剂盒进行体系配制，反应总体积为25 μL，组分构成见表2。

表2 人感染H7N9禽流感扩增体系组分构成

组分 体积（μL）

2×RT-PCR Buffer 12.5

25×RT-PCR Enzyme Mix 1.0

H7上游引物 0.5

H7下游引物 0.5

H7探针 0.5

N9上游引物 0.5

N9下游引物 0.5

N9探针 0.5

RNase Free Water 3.5

将上述反应液混匀，分装每管20 μL，将5 μL模板加入分装好的PCR小管，分别做好标记。同时分别以DEPCH2O和RNA阳性模板作为阴性和阳性对照。使用Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪进行病毒核酸检测，反应程序为：45 ℃ 10 min，1个循环；95 ℃ 10 min，1个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40个循环。

甲乙型流感、季节性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感检测分别使用北京金豪公司的系列试剂盒进行体系配制，反应总体积均为25 μL，组分构成见表3。

表3 甲乙型流感、季节性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感扩增体系组分构成

组分 体积（μL）

Mix 20

Tag聚合酶 1

逆转录酶 0.35

将上述反应液混匀，分装每管20 μL，加入5 μL模板，分别做好标记。同时分别以DEPCH2O和RNA阳性模板作为阴性和阳性对照。使用Bio-Rad IQ5实时荧光定量PCR仪进行病毒核酸检测，反应程序为：50 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min，1个循环；95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，5个循环；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，40个循环。

2 结果

2.1 本疾控中心检测结果 检验结果显示，甲型流感通用引物、H7和N9特异性引物的扩增结果均为阳性，其中H7和N9特异性引物的扩增结果结果见图1。

2.2 省疾控中心和国家疾控中心复核检测结果 按照《人感染H7N9禽流感疫情防控方案》要求，郑州市疾控中心将初步检测呈阳性的样本送至河南省疾控中心和国家疾控中心进行复核检测，结果与本实验室检测结果一致，证实该病例样本人感染H7N9禽流感病毒核酸阳性。

3 讨论

自2013年2月份以来，人感染H7N9禽流感疫情已波及我国多个省份，病例数持续增加，但截至目前病例分布仍呈现高度散发的特点，尚无人传人的确切证据[7-9]。传染源目前尚不明确，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。根据现已掌握的流行病学资料，患者多为从事禽类养殖、销售、宰杀、加工业者，以及在发病前1周内接触过禽类者[10-11]。郑州市首例人感染H7N9禽流感患者王某正是从事活禽宰杀销售工作的，发病前与禽类有明确的接触史。

甲型流感病毒血清型较多，发病初期的临床症状又较为相似，这为病例的临床鉴别诊断带来了较高的难度。人感染H7N9禽流感重症患者预后差。重症患者病情发展一般十分迅速，表现为重症肺炎，体温39 ℃以上，常发生呼吸困难；病情进一步恶化出现急性呼吸窘迫综合征、休克及急性肾损伤等，病死率较高[2-3]。因此，实验室准确、高效的诊断技术，对于疑似病例的早诊断、早治疗，减轻患者的病痛，挽救患者的生命具有重要意义。目前最准确的诊断方法就是从患者呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性[12-14]。Real-time RT-PCR检测流感病毒核酸，方法成熟、敏感度高、特异性强、重复性好，是目前实验室首选的快速检测方法[15]。

流感样病例标本采集质量的好坏是实验室能否得到客观、准确诊断结论的前提和基础，临床上对此应该给予高度重视。在本次人感染H7N9禽流感病例的首次实验室标本采集和检验中，检测结果为阴性。在几天之后的二次标本采集和检验中，检测结果又为阳性。在两次病例标本的采集和检验过程中，相同点是均是使用同批次的病毒采样管和检验试剂、同样的仪器设备和检验方法；不同点是两次标本采集的采样人员不同，所采集标本的种类亦不相同，同时患者的病情也在不断地发展变化过程之中。笔者分析造成两次实验室检测结果不一致的原因大概有两种可能：一是第一次检测的标本采集质量不过关。流感样病例标本的采集首先应选用合格的病毒采样管和聚丙烯纤维头拭子进行采样。其次，采样部位要准确。咽拭子应采集患者的悬雍垂后咽后壁及双侧扁桃体，应尽量避免接触舌头、口腔内壁等含菌较高的部位。鼻拭子应深入鼻鄂部采集。最后应注意的是，采样要有一定的力度，尽可能的多采集一些标本。在第一次标本采集过程中，有可能是在采样部位上掌握的不够准确，或是采样力度不够造成了标本采集质量不过关。二是第二次检测的标本更具有典型性。第二次标本采集除了采集了患者的鼻、咽拭子外，医院方面还使用专用设备采集了患者的下呼吸道分泌物，这更加符合人感染H7N9禽流感病例标本的要求，提高了病毒检测的阳性率。

实验室应做好相关检验技术和物资的贮备，建立健全应急检验工作预案，做到有条不紊地应对流感疫情等突发公共卫生事件。本文详细介绍了郑州市首例人感染H7N9禽流感病例的实验室检测方法和过程，旨在进一步提高实验室应急检测能力，为流感疫情的防控提供及时可靠的诊断依据。

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（收稿日期：2014-04-16） （本文编辑：蔡元元）

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（收稿日期：2014-04-16） （本文编辑：蔡元元）