JC-1单染法检测CCCP对内皮细胞线粒体膜电位的影响

官福新，周露露，张宸豪，李 妍* (吉林医药学院：.药学院0级药学本班，.药学院00级药学本班，.检验学院，吉林 吉林 0)

线粒体是细胞内能量代谢的重要细胞器，是决定生存的控制中心。在细胞生物学、临床医学、肿瘤学等研究领域，均需要通过检测细胞线粒体功能而开展研究或辅助诊断疾病[1]。粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)变化可反应线粒体功能的变化，有必要建立和优化简单、敏感和快速检测MMP的方法[2]。本研究采用碳酰氰基-对-氯苯腙(carbonyl cyano-to-chlorobenzene hydrazone，CCCP)来损伤线粒体功能，分别装载常用荧光探针Rh123和新型探针JC-1进行，流式细胞术分析CCCP损伤细胞后MMP的变化，探索检测过程中的注意事项，建立更为稳定和敏感的MMP分析方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

人脐静脉内皮细胞ECV304保存于液氮中。荧光探针JC-1和Rh123购自上海碧云天生物技术研究所；1640培养液购自Gibco公司；小牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶和EDTA为Sigma公司产品。流式细胞仪型号为Epics XL(美国贝克曼公司)。

1.2 细胞培养和传代

实验前1周复苏ECV-304细胞，含10%小牛血清1640培养液、5%CO2、饱和湿度和37℃条件下培养。含0.5%胰蛋白酶0.2%EDTA的消化液消化细胞，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 CCCP处理细胞

调细胞密度为105/mL,按每瓶10 mL接种于75 mL培养瓶，培养24 h。加入CCCP储存液至终浓度分别为0、0.1、1和10 μmol/L,处理细胞20 min后，消化收集细胞，PBS洗2次。

1.4 装载探针和流式细胞术分析

每组取5×105个细胞，按如下方法装载Rh123探针并用流式细胞术分析：按说明书(产品编号C2006)方法配制JC-1染色工作液和染色缓冲液(冰沐)；500 μL JC-1染色工作液悬细胞，37 ℃条件下反应30 min；离心吸弃上清，用冰沐的染色缓冲液洗涤细胞2次；500 μL染色缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪FL1通道(525 nm)的检测细胞发射的荧光。每组取5×105个细胞，按如下方法装载Rh123探针和流式细胞术分析：将细胞悬浮于500 μmol PBS，加入Rh123 储存液(1.25 mol/L) 1 μL，混匀后37 ℃水沐中避光反应30 min；离心弃上清，PBS洗涤2次后用流式细胞仪FL1通道检测细胞发射的荧光。

2 结 果

2.1 JC-1法检测CCCP对线粒体膜电位的影响

装载JC-1探针、流式细胞术分析CCCP处理后细胞内绿色荧光的变化，结果表明，细胞内代表JC-1单体的绿色荧光随CCCP浓度而增加(图1)。

图 1 JC-1法检测CCCP对线粒体膜电位的影响

2.2 Rh123法分析CCCP对线粒体膜电位的影响

Rh123染色后、流式细胞术分析CCCP处理后细胞内绿色荧光的变化(图2)。与对照组比较，0.1 μmol CCCP处理后，Rh123的荧光强度下降，但伴随CCCP浓度增加(1和10 μmol)后，Rh123的绿色荧光反而增加，即荧光强度与CCCP对线粒体功能损伤的效应未呈现对应关系。

图 2 Rh123法分析CCCP对线粒体膜电位的影响

3 讨 论

线粒体是细胞内能量转换和控制细胞凋亡的重要细胞器，也决定生存与死亡的控制中心[3]。部分不育男性的精子运动能力下降，可检测到精子的线粒体膜电位下降。心脏在缺血后再灌注时，心肌细胞内活性氧增加，导致细胞线粒体功能受损和线粒体膜电位下降。增殖旺盛的肿瘤细胞，线粒子功能活跃，而采用药物干预线粒体功能是治疗肿瘤的策略之一。简言之，检测线粒体功能在细胞生物学、临床医学和肿瘤学等研究领域中均有重要应用。

荧光染料Rh123可因线粒体内外的电位差而吸附结合于线粒体，成为分析线粒体功能的常用染料[4]。但被检测的细胞大量坏死或发生晚期凋亡后，细胞膜的通透性增加，加速Rh123进入细胞内，线粒体对其吸附的能力下降；在染色后洗涤的过程中，Rh123又不同程度地漏出。实际工作中发现，细胞发生严重坏死的情况下，Rh123的荧光与线粒体膜电位无较好对应关系。JC-1是一种新型荧光探针，进入线粒体后，其存在状态和发射荧光与线粒体的功能联系紧密：在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1主要以单体形式存在，发绿色荧光[5]。CCCP可以浓度依赖的方式损伤线粒体功能，导致线粒体膜电位下降。通过研究发现，在不同浓度CCCP处理后，JC-1染色后所检测的绿色荧光强度随着CCCP浓度增加而增强。但以Rh123为探针，其发射的荧光在CCCP浓度较高时，呈现假性增加的趋势。

简言之，与Rh123比较，JC-1是更为理想的检测线粒体膜电位的荧光探针。除探针种类的因素外，实验过程尚需要在如下方面注意，以保证分析结果稳定：①在培养瓶或孔板内所接种细胞量要适当，以免细胞密度过高导致代谢毒性产物增加、细胞生长受抑制；②可尝试不同的消化液来消化、传代细胞，避免此过程中过度损伤细胞；③洗涤细胞的过程中，可用移液器吸去上清液，既减少细胞的丢失又减少液体残留，达到充分洗涤未结合的探针的目的。

致谢：感谢公共卫生学院王长文副教授在文献阅读和英文写作过程中给予的悉心指导。

参考文献：

[1] Ou Xianghong,Li Sen,Wang Zhenbo,et al.Maternal insulin resistance causes oxidative stress and mitochondrial dysfunction in mouseoocytes[J].Hum Reprod,2012,27(7):2130-2145.

[2] 陈 莎，张 翔，张舒越，等.抗霉素A直接刺激线粒体所引起的超氧阴离子含量和膜电位变化的单线粒体水平研究[J].厦门大学学报:自然科学版,2013,52(4):525-528.

[3] Kroemer G,Reed J C.Mitochondrial control of cell death[J].Nat Med,2000,6(5):513-519.

[4] 安 冉，董 强.凋亡过程中线粒体膜透化的常用检测方法[J].中华脑血管病杂志:电子版，2009,3(1):33-37.

[5] 李 妍.流式细胞术入门及平台化管理[M].长春：吉林大学出版社，2012.