3种药用石斛鉴别特征的综合分析

包英华，潘超美，白 音

(1．广州中医药大学中药学院，广州510006;2．韶关学院英东生命科学学院，韶关512005)

石斛为我国常用名贵中药材，以新鲜或干燥茎入药，具有益胃生津，滋阴清热等功效，主要用于治疗阴伤津亏、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明和筋骨痿软等病症［1］．枫斗是药用石斛的初加工品，通常利用石斛新鲜茎干边加热边扭成螺旋形或弹簧状，并烘干而成．铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo、细茎石斛(铜皮石斛)D．moniliforme L．Sw．和齿瓣石斛(紫皮石斛)D．devonianum Paxt．是加工枫斗的主要品种，市场占有量大［2］．然而，3种药用石斛的市场价格差异较大，其中铁皮石斛的价格远高于其他2种药用石斛，而利用该3种药用石斛加工而成的枫斗在外观上极为相似，难以鉴别．

石斛鉴定方法有性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定和DNA分子鉴定等［3］．不同的鉴定方法均有各自的优缺点，性状和显微等传统鉴定方法简单、快速，但缺少一些专属性鉴别特征;理化和分子鉴定方法能够提供较多鉴别特征，但操作程序多，运行成本较高等;红外光谱鉴定方法是反映化学成分的综合信息，操作简便、成本低和重复率高等诸多优点．

本文利用显微、红外光谱和AFLP分子鉴定等方法比较研究3种药用石斛的鉴别特征，整合3种鉴定方法的优势，明确3种药用石斛的综合鉴别特征，为选择和鉴别铁皮石斛、细茎石斛和齿瓣石斛提供依据．

1 材料与方法

1．1 材料

3种药用石斛分别采自于云南、贵州、安徽、广东、广西和浙江等当前野生和栽培资源比较集中的地区，每个区域取3份样品(表1)．原植物经鉴定后，样品现保存于韶关学院石斛种质资源圃．

表1 实验材料及采集地Table 1 Location and sampling size of the three kinds ofmedicinal Dendrobii

1．2 方法

1．2．1 茎部显微结构观察与分析 取茎中部，切成3～5小块(厚度约5．0 mm)，用番红固绿复染．选择3个较为清晰的茎段切片，用LEICA DM/LS双筒光学显微镜观察，用C1型和C4型显微镜测微尺测量其显微结构．利用SPSS 20．0软件对3种药用石斛显微特征进行方差分析．

1．2．2 红外光谱特征分析 取60℃干燥至恒质量的供试材料粉末(过75μm筛)约3 mg，与200 mg溴化钾(优级品)混合研磨充分均匀，用BJ-15型压片机制作样品溴化钾压片，并用PE傅里叶红外光谱仪进行扫描测定．检测器分辨率为4 cm-1;检测范围:4 000～400 cm-1;扫描信号累加16次，OPD速度为0．2 cm-1·s-1，扫描时扣除 H2O和 CO2干扰．采用Thermo Scientific Omnic Specta软件包比对分析3种药用石斛的红外光谱图及其二阶导数光谱图．

1．2．3 AFLP 分子标记特征的分析方法［4-5］

(1)DNA提取及酶切连接:改良CTAB法对样品DNA进行提取，用Ultrospc 2000紫外/可见分光光度计检测DNA纯度和浓度，用EcoRⅠ和MseⅠ限制性内切酶对样品基因组DNA进行酶切．

(2)PCR扩增及数据分析:采用Gene Amp 9600型PCR仪进行扩增．用ABI377测序仪对扩增产物进行电泳，获得电泳扩增图谱．用GENESCAN3．1软件分析扩增条带，NTSYSpc 2．11F软件包的SimQual程序求遗传距离，利用popgene32软件计算遗传相似性指数和遗传距离(Nei，1972)．基于 Nei's(1972)遗传距离构建UPGMA聚类图．

2 结果与分析

2．1 3种药用石斛茎显微特征的比较分析

3种药用石斛的茎横切面结构可清晰表明由表皮、基本组织和维管束3部分组成，但在结构上存在一定的差异(图1、表2)．

药用石斛茎表皮外部均覆盖一层角质层，表皮细胞为一层，排列整齐．细茎石斛和齿瓣石斛角质层厚度无显著差异，厚度约7．0～8．0μm;铁皮石斛角质层比较薄，约4．9μm．按照石斛茎表皮细胞的细胞壁加厚情况，铁皮石斛表皮细胞属于不均匀加厚型、细茎石斛表皮细胞属于无增厚型，齿瓣石斛表皮细胞属于均匀加厚型［6］．铁皮石斛和齿瓣石斛表皮细胞壁厚度无显著差异，厚度约12．0～13．0μm;细茎石斛表皮细胞壁比较薄，厚度为9．1μm．

靠近茎表皮细胞向基本组织细胞壁通常加厚，形成厚壁组织．薄壁组织细胞大小不等，形状各异．铁皮石斛和细茎石斛厚壁组织厚度无显著差异，厚度约15．7～17．5μm;齿瓣石斛厚壁组织细胞壁加厚程度明显，厚度为30．0μm．

茎部维管束分散分布于基本组织中，外侧或两侧通常有鞘纤维包围．铁皮石斛、细茎石斛和齿瓣石斛茎的维管束大小存在极显著差异，分别为78．7、90．9和68．1μm．三者鞘纤维厚度无显著差异．

图1 3种药用石斛的茎显微特征Figure 1 Themicroscopical characters of the stem of threemedicinal Dendrobii

表2 3种药用石斛茎显微特征Table 2 Analysis to the stem ofmicroscopic characters of three medicinal Dendrobii μm

2．2 3种药用石斛红外光谱特征分析

3种药用石斛红外光谱图在1 800～1 000 cm-1范围内，共出现4个峰，分别是1 738、1 618、1 424、1 245 cm-1．其中 1 323、1 055 cm-1是细茎石斛的特征峰．1 511、1 375 cm-1是齿瓣石斛和细茎石斛共有的特征峰;1 155、1 028 cm-1是齿瓣石斛和铁皮石斛的共有特征峰(图2)．

在二阶导数光谱图显示中，3种药用石斛的共有峰和特征峰的数量明显增加．在1 800～1 000 cm-1范围内，出现共有峰11个(图3-图5)．其中1 585、1 217和1 049 cm-1是细茎石斛的特征峰，1 569、1 450、1 225 和1 073 cm-1是铁皮石斛和齿瓣石斛的共有特征峰，1 011 cm-1是细茎石斛和齿瓣石斛的共有特征峰(图3-图5)．

2．3 3种药用石斛的AFLP分析

根据扩增效果，从8对引物(E-AAG/M-CAC、EAAG/M-CTC、E-AAG/M-CTG、E-ACG/M-CAC、EACG/M-CAG、E-ACG/M-CTA、E-ACG/M-CTG 和 EACG/M-CTT)中，选取引物E-ACG/M-CTG分别对3种药用石斛进行AFLP扩增(图6)．结果表明，共得到113个扩增位点，其中多态性位点111个，占总扩增位点的98．3%．在3种药用石斛中，齿瓣石斛特异性位点有2个、细茎石斛特异性位点有9个和铁皮石斛特异性扩增位点有19个．聚类分析结果表明，齿瓣石斛与细茎石斛遗传相似性指数为0．475 4，齿瓣石斛与铁皮石斛遗传相似性指数为0．392 3，细茎石斛与铁皮石斛的遗传相似性指数为0．420 3(图7)．

图2 3种药用石斛红外光谱图谱(4 000～400 cm-1)Figure 2 FT IR spectra of the threemedicinal Dendrobii

图3 铁皮石斛的二阶导数光谱(1 800～1 000 cm-1)Figure 3 The second derivative FT-IR spectrum of D．officinale

图4 细茎石斛的二阶导数光谱(1 800～1 000 cm-1)Figure 4 The second derivative FT-IR spectrum of D．moniliforme

图5 齿瓣石斛的二阶导数光谱(1 800～1 000 cm-1)Figure 5 The second derivative FT-IR spectrum of D．devonianum

图6 3种药用石斛的AFLP扩增图(E-ACG/M-CTG)Figure 6 AFLP amplification from threemedicinal Dendrobiiusing primer E-ACG/M-CTG

图7 3种药用石斛的AFLP聚类图(E-ACG/M-CTG)Figure 7 AFLP dendrogram among three medicinal Dendrobii using primer E-ACG/M-CTG

3 讨论

铁皮石斛、细茎石斛(铜皮石斛)和齿瓣石斛(紫皮石斛)是药用石斛中品质较好、用量较大的药用石斛品种．然而，三者之间的品质差异明显，价格悬殊较大，在石斛枫斗市场销售和临床应用过程中，普遍存在相互混淆、相互替代等问题．

管燕红等［7］和樊丽彤等［8］分析了铁皮石斛和紫皮石斛的显微、薄层色谱鉴别特征，为铁皮石斛鉴别提供了依据．从本研究结果来看，3种药用石斛显微特征存在一定差异，尤其是茎表皮细胞的形状特征对3种药用石斛的鉴别提供了有效依据．但是，3种药用石斛的大多数显微特征很相似，无法提供更多更可靠的鉴别特征．这也是目前整个药用石斛难以鉴别的主要因素之一．

李兆奎等［9］对5种药用石斛(铁皮石斛、齿瓣石斛、细茎石斛、钩状石斛和马鞭石斛)进行红外光谱分析，结果表明在1 700～1 200 cm-1和1 000～700 cm-1处特征性明显．本文在红外光谱及其二阶导数光谱分析基础上，进一步明确了3种药用石斛的红外光谱特征，其中细茎石斛有8个特征峰、齿瓣石斛有8个特征峰以及铁皮石斛有6个特征峰．但是，红外光谱是样品成分的叠加图，有些特征信息受其他成分的干扰．因此，在减少干扰的同时需要结合其他鉴定方法，才能得到更为准确的鉴定结果．

虞弘等［10］对4种石斛属植物(束花石斛、流苏石斛、细茎石斛和蝶花石斛)进行AFLP分析，结果表明该分子标记分析方法能够用于药用石斛的鉴定．本文对3种药用石斛进行AFLP分析，也明确了具有鉴别价值的扩增位点，以及其遗传相似性指数．

对3种药用石斛的枫斗类产品来讲，首先选用显微鉴定方法，重点观察其茎表皮细胞的结构特征．然后观察红外光谱特征，寻找其特征峰信息．最后分析其AFLP扩增结果，明确其特异性扩增位点．综合分析以上鉴别特征，能够准确鉴别该3种药用石斛枫斗．

总之，利用单一的鉴别方法很难解决药用石斛的鉴别问题，必须要多种鉴定方法的综合应用，才能取得更加准确的鉴别效果．

［1］国家药典委员会，中华人民共和国药典:一部［M］．北京:中国医药科技出社，2010:85-86．

［2］包雪声，顺庆生，陈立钻．中国药用石斛［M］．上海:上海医科大学出版社，2001．

［3］白音，包英华，王文全，等．药用石斛鉴定方法的研究进展与趋势［J］．北京中医药大学学报，2010，33(6):421-424．Bai Y，Bao Y H，Wang W Q，et al．Research progress and trends of the authentication methods ofmedical Dendrobii［J］．Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，2010，33(6):421-424．

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