双酚A对河蚬呼吸代谢和抗氧化酶的毒性研究

张悦君，曾丽璇，康 园，张秋云

(华南师范大学化学与环境学院;教育部环境理论化学重点实验室，广州510006)

作为一种重要的有机化工原料，双酚A(bisphenol A，BPA)被广泛应用于塑料增塑剂、聚碳酸酯、环氧树脂、抗氧化剂、农药、化妆品等生产中．日常生活中的塑料容器、食品包装材料、容器内壁涂料上均可降解出BPA［1-2］．近年来针对BPA开展了广泛的研究，均采用鱼类、水蚤和海洋贝类作为指示生物进行研究［3-4］，关于BPA对双壳贝类的毒性研究相对较少．河蚬(Corbicula fluminea)是一种主要栖息于淡水及咸淡水中的常见双壳类，为河流中重要底栖动物．作为江河水库等淡水生态系统的优势种，影响着当地水生生态系统的物质循环［5］．由于河蚬具有分布广泛、个体较大、生活史较长、迁移性小、不主动摄取食物、容易采集等特点，同时作为一种滤食性的动物，以水中的浮游生物(如硅藻、绿藻、原生动物、轮虫等)为食料［6］，在食物链中具有重要作用，对毒物有很高的浓缩系数，能直接反映水体的污染状况，因此河蚬被认为是水生生态毒理学上目标污染物低剂量长期作用下的毒性效应的指示生物［7］．国内BPA对河蚬的生态毒理研究尚处于起步阶段．

由于环境水体中BPA含量较低，而低浓度污染物对生物的危害在短期内难以察觉［8］，动物耗氧率(Oxygen Consumption Rate，OCR)和排氨率(Ammonia Excretory Rate，AER)的变化可作为反映某些污染物毒性大小的敏感指标［9］．同时超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)等抗氧化酶是生物体内保护系统的主要酶，其活性可作为生物逆境生理和衰老生理指标［10］．本文采用静态染毒法，研究BPA急性暴露及亚急性暴露对河蚬呼吸代谢及抗氧化酶活性的影响，探讨BPA对河蚬的毒性效应，为防治BPA污染提供依据．

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

BSA1245S-CW电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);UV-3100PC紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);玻璃匀浆器．

双酚A(分析纯);乙醇(分析纯)．

1．2 试验动物

试验所用河蚬来自珠江三角洲河网中水质较好的增江．选取壳长(25．0 ±2．0)mm，壳高(19．40 ±0．20)mm，体质量为(4．00 ±0．40)g 的健康河蚬用于试验．用经过3天自然脱氯和已充分曝气的自来水将河蚬在试验室暂养1周，暂养期间水温为(20±1)℃，自然光照．

1．3 试验方法

1．3．1 急性毒性试验 急性毒性采用半静态换水式试验，每24 h更换1次试验液，换水后加入BPA至初始质量浓度．试验容器为定制的容积为1 L的玻璃水族箱，每升水中放10只河蚬，试验期间不喂食，试验条件控制在水温(20±1)℃，pH值7．5～8．0，溶解氧7～8 mg/L．预试验设置3个间隔较大的质量浓度梯度，每组设3个平行，求出48 h的100%死亡、无死亡和大致半致死质量浓度．正式试验按照预试验所得结果以等对数间距设置5个试验质量浓度组(5、7、10、14、20 mg/L)和 1 个空白对照组、1个溶剂对照组(体积分数0．1%的乙醇，下同)，每组设3个平行试验．试验期间连续观察受试对象的活动情况，及时清除死亡的河蚬和代谢物，每隔24 h记录河蚬的死亡情况．个体死亡的判断标准:河蚬外膜收缩、刺激时腹足不能收缩、双壳张开，多次用镊子适度敲击壳体并夹紧双壳而没有自动闭壳反应．暴露96 h后计算其半致死浓度(median lethal concentration，LC50)．然后按下式计算安全浓度(SC):SC=96 h LC50×0．01．

1．3．2 亚急性毒性试验 亚急性毒性试验的质量浓度设置参考了急性毒性试验所得的数据结果，以96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和 1/2设置4个质量浓度组，另设1个溶剂对照组(0．1%乙醇)，每组设3个平行，对河蚬进行亚急性染毒试验，试验采用半静态换水，暴露期间的实验方法与96 h-LC50急性毒性试验相同，每天观察记录河蚬的死亡情况，及时清除死亡的河蚬和代谢物．

1．3．3 耗氧率和排氨率的测定 采用刘其根［11］等的方法进行测定．根据试验前后代谢瓶内水中的溶解氧及氨氮含量，按下列公式计算河蚬的耗氧率和排氨率:

式中:OR为单位体质量耗氧率(mg·g-1·h-1);DO0和DOt为试验开始、在t时间结束时水中DO的含量(mg/L);V为代谢瓶中水的体积(L);W为河蚬质量(g);t为试验持续时间(h)．

式中:NR为单位河蚬个体质量排氨率(mg·g-1·h-1);N0和Nt为试验开始、在t时间结束时水中NH3-N的质量浓度(mg/L);V为代谢瓶中水的体积(L);W为河蚬质量(g);t为试验持续时间(h)．

1．3．4 酶活性的测定 亚急性毒性试验结束后，从各组中各取出数只河蚬尽快剖开，用滤纸对其吸干水分后，称取软体组织0．50 g用6．7×10-3mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7．0)3．0 mL进行匀浆，匀浆液倒入离心管中，加3 mL磷酸盐缓冲溶液冲洗匀浆器后，也倒入离心管中，在4 000 r/min离心30 min，取上清液为粗酶液．

(1)SOD活性测定 采用邹国林［12］改进的邻苯三酚自氧化法，波长λ=325 nm．SOD酶活性单位定义为:每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶活性单位．

(2)CAT活性测定 采用徐镜波等［13］的紫外分光光度法进行测定，波长λ=240 nm．CAT酶活性定义为:一个过氧化酶单位相当于在规定条件下，于25℃、pH 7．0，每分钟分解1μmol过氧化氢所需的酶量．

(3)总蛋白含量的测定 采用Bradford法［14］，即考马斯亮蓝法．10．00 mL Bradford染色液加入0．30 mL待测蛋白，混匀后在595 nm处检测吸光度．以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白做出的标准曲线计算各样本蛋白含量．

1．4 数据处理

试验数据使用SPSS 16．0软件进行统计分析，用PROBIT模型计算LC50及其95%置信区间(95%C．I．);文中描述性统计值以3次平均数±标准偏差(mean±SD)表示，组间数据采用T检验法进行分析，得出显著性差异的相关信息，P＜0．05认为存在显著性差异，P＜0．01认为存在极显著差异．

2 结果与讨论

2．1 BPA对河蚬的急性毒性分析

急性毒性试验结束后，空白对照组以及BPA溶剂对照组均无死亡．观察发现，试验期间未死亡个体的活动能力下降，用镊子适度敲击河蚬壳体时，其闭壳速度缓慢，用玻璃棒刺激河蚬的腹足时，其收缩速度缓慢，其外套膜边缘有黏性絮状物包被．

在同一试验质量浓度组中，随着暴露时间的延长河蚬死亡率均呈现出逐渐增加的趋势(表1)．表示化学物质对生物的生态毒理学危害性可根据其LC50分为4个等级［15］:≤1 mg/L为极高;1～10 mg/L为高毒;10～100 mg/L为中毒;＞100 mg/L为低毒．参照分级标准，BPA对河蚬的毒性为高毒．

表1 BPA对河蚬的急性LC50值Table 1 LC50 value of Asian clam for BPA

目前，已有许多学者关注BPA对水生生物的半致死浓度．

比较表1和表2可以看出，河蚬对BPA的耐受性远高于鲤鱼，与泥鳅、水螅、斑马鱼和雌性日本青鳉较为接近，由此得出不同水生生物对BPA的耐受性差异较大，可能与不同水生生物的呼吸渠道以及代谢解毒能力的差异相关，其中泥鳅除腮之外还可用皮肤呼吸，而鱼鳃是污染物发挥毒性作用的靶器官之一，因此，与鲤鱼、斑马鱼相比泥鳅对BPA的耐受性更强［18］;而河蚬作为双壳贝类生物，具有坚硬的外壳保护，能有效减少身体与污染物的接触，从而降低污染物的毒性损害［21］，但同时河蚬作为活动力差的贝类品种，因无回避能力，暴污程度较大，故其对BPA的耐受性介于不同水生生物之间．

表2 BPA对水生生物的急性LC50值Table 2 LC50 value of aquatic organisms for BPA

2．2 BPA对河蚬的亚急性毒性分析

根据急性毒性试验结果(表1)BPA对河蚬的96 h-LC50为6．34 mg/L，以 BPA 对河蚬的 96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和1/2设置4个质量浓度组，即0．63、0．79、1．59、3．17 mg/L．7 d 的亚急性毒性试验结束后，对照组均无死亡，其他浓度组死亡率均低于5%．

2．2．1 BPA对河蚬呼吸代谢的影响 在BPA暴露下，河蚬耗氧率和排氨率随着暴露质量浓度的升高(表3)，耗氧率和排氨率先降低后升高再降低，各暴露质量浓度组中的耗氧率和排氨率均低于溶剂对照组．在低质量浓度暴露下(0～0．79 mg/L)，河蚬耗氧率和排氨率表现为受到抑制，其中在0．63 mg/L时耗氧率和排氨率均受到显著抑制(P＜0．05)，而在0．79 mg/L时，耗氧率和排氨率均受到极显著抑制(P＜0．01);随着BPA暴露质量浓度的升高(0．79～1．59 mg/L)，河蚬耗氧率和排氨率呈升高趋势，但仍显著低于溶剂对照组(P＜0．05);而随着暴露质量浓度的继续升高(1．59～3．17 mg/L)，耗氧率和排氨率再次降低表现为受到极显著抑制(P＜0．01)．

表3 BPA对河蚬呼吸代谢和抗氧化酶活性的影响Table 3 Effect of BPA on respiratorymetabolism and antioxidant enzymes of Asian clam

2．2．2 BPA对河蚬抗氧化酶活性的影响 在BPA暴露下，河蚬软体组织SOD和CAT活性随着暴露质量浓度的升高也有显著的变化(表3)，总体趋势为随着BPA质量浓度的升高SOD和CAT活性先降低后升高再降低，其中各质量浓度组中CAT活性均低于溶剂对照组．在低质量浓度暴露下(0～0．79 mg/L)，河蚬 SOD和 CAT活性受到一定抑制，在0．63 mg/L时SOD和CAT活性均受到轻微抑制，在0．79 mg/L时，SOD和CAT活性均受到极显著抑制(P＜0．01);随着BPA暴露质量浓度的升高，河蚬SOD和CAT活性呈升高趋势，其中在1．59 mg/L时，SOD的活性受到显著诱导(P＜0．05)，而 CAT仍极显著低于溶剂对照组(P＜0．01);随着暴露质量浓度的继续升高(1．59 ～3．17 mg/L)，SOD 和CAT活性再次降低表现为受到极显著抑制(P＜0．01)．

在BPA较低暴露质量浓度下，河蚬的耗氧率和排氨率、SOD和CAT活性有所降低，其中在0．63 mg/L时均无极显著性的变化，直至0．79 mg/L时其耗氧率和排氨率以及2种酶活性才受到极显著性的抑制，随着质量浓度的继续升高，河蚬耗氧率和排氨率、2种酶活性相对均有所升高，而在浓度极高时其耗氧率和排氨率以及2种酶活性才又受到极显著性的抑制，表明此时BPA对河蚬抗氧化酶系统和呼吸代谢能力产生了一定的毒性效应．

3 结论

BPA对河蚬的96 h-LC50为6．34 mg/L;在试验质量浓度范围内，河蚬耗氧率和排氨率、SOD、CAT活性随暴露质量浓度升高均呈现先下降后上升再下降的趋势，表明BPA可对河蚬产生明显的氧化胁迫和毒性效应．

总体而言，在本试验中，河蚬耗氧率和排氨率以及2种酶活性指标对BPA较敏感，且均呈现出较好的一致性和规律性，至于这些呼吸代谢以及抗氧化酶内在的变化机理，这将是下一步在分子水平上的研究重点．

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