实蝇类害虫分子鉴定研究进展

陈韶萍， 黄 振， 郭琼霞*， 刘长明

1福建出入境检验检疫局,福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建 福州 350001 2福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002

实蝇类害虫隶属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae，约有500属4500种，除了南极与北极这2个高纬度区域，实蝇在全世界的热带、亚热带以及温带地区均有分布(梁广勤等，2008；王振华等，2009)。世界上具有重要经济意义的实蝇主要分为5个类群，即按实蝇属Anastrepha、果实蝇属Bactrocera、寡鬃实蝇属Dacus、腊实蝇属Ceratitis以及绕实蝇属Rhagoletis(黄振和黄可辉，2012; 梁广勤等，2008)。我国有实蝇400余种，绝大多数种类为水果、蔬菜和花卉作物的害虫，约有15属22亚属150余种，其中70余种被认为是具有危险性或潜在危险性的重要害虫(黄振，2010)；同时其危害的寄主范围广，在进境口岸经常被截获(黄振等，2012、2014)。

长期以来，实蝇类害虫的口岸检疫鉴定主要以完整的成虫外部形态特征为依据。然而，在口岸中经常截获的大多是实蝇幼虫，在这种情况下，通常是将幼虫在室内饲养为成虫再进行鉴定，因其需要花费较长的时间，从而影响果蔬进出口贸易的通关速度。近年来，随着分子生物学的快速发展，越来越多的分子生物学技术被用于昆虫分类鉴定，如同工酶技术、DNA条形码技术、PCR技术、随机扩增多态性DNA技术(RAPD)、限制性片段长度多态性技术(RFLP)、扩增片段长度多态性技术(AFLP)、基因芯片技术等。这给实蝇分类鉴定带来了契机，即在传统分类的基础上借助分子手段，可以更好地解决实蝇物种鉴定问题。本文主要对目前已经被用于实蝇鉴定的分子生物学技术的优缺点及其国内外研究进展进行综述，以期为今后选用分子生物学技术鉴定实蝇种属提供参考。

1 DNA条形码技术

1. 1 原理及特点

2003年，加拿大动物学家Paul Hebert博士提出了DNA条形码(DNA barcoding)的概念。DNA条形码技术的原理类似于商品条形码，关键是对物种的某一段标准目的基因片段进行大范围比对分析，进而识别、鉴定未知的物种或者发现新种及隐存种等(Hebertetal.，2003)。近年来，由于DNA条形码技术操作快速简便、结果准确性高以及可进行非专家物种鉴定等特点，为生物分类学提供了信息化的分类标准和有效的分类手段，成为目前发展速度最快的前沿学科之一。

目前，被选作标记的分子基因很多，但仅COⅠ (cytochrome oxidase Ⅰ或coxⅠ) 基因被选为DNA条形码的靶标基因。COⅠ基因是位于线粒体呼吸链上的编码细胞色素氧化酶亚基Ⅰ的基因，该基因具有几个特点(Lin & Danforth,2004)：(1)大部分为母系遗传，相对保守且没有内含子，不包含重复序列；(2)与其他基因相比，进化速率较快；(3)AT含量较高，且在细胞内为多拷贝，比较容易被扩增。此外，COⅠ基因有足够的变异能够将不同物种区分开。

1. 2 国内外研究进展

李志红等(2011)利用DNA条形码技术成功鉴定了采自泰国四色菊市番石榴烂果中的番石榴实蝇Bactroceracorrecta(Bezzi)幼虫。Abd-El-Samie & El Fiky (2011)基于COⅠ序列，分析阐述了在埃及各地区建立种群的桃实蝇Bactrocerazonata(Saunders)的系统发育关系。姜帆等(2011)利用DNA条形码技术和BOLD系统，对广西南宁地区苦瓜中的实蝇幼虫样品进行了序列测定、比对和分析。Liangetal.(2011)利用试验获得的25种实蝇的155条COⅠ序列，通过构建系统发育树与遗传距离分析，证实了COⅠ条形码序列能准确鉴定、识别除橘小实蝇Bactroceradorsails(Hendel)复合种外的中国果实蝇种属。Liuetal.(2011)基于形态学及COⅠ条形码序列，成功鉴定了来自布隆迪的入侵果实蝇BactrocerainvadensDrew。刘慎思等(2012)利用DNA条形码技术构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系，并证实该物种识别技术可用于口岸截获的实蝇类害虫幼体及残体的准确鉴定。Jiangetal.(2013)利用DNA条形码技术，基于SNP位点设计了能够准确鉴定、识别番石榴实蝇的特异性引物。

1. 3 实蝇DNA条形码的应用情况

根据BOLD Systems现有的数据，总结了截至2014年10月22日实蝇DNA条形码的种类、已公布的记录数及其涉及的实蝇种类(表1)。由表1可以看出，实蝇DNA条形码的种类主要有COⅠ-5P、COⅠ-3P、COⅡ、COⅢ、CYTB、atp6、28S等7种。其中以COⅠ标记为主，已公布的记录数为4540，是其他5种DNA标记的113. 5倍，其中又以COⅠ-5P标记为主，研究的实蝇种类达315种，COⅠ-3P标记的有116种；果实蝇属被研究公布的记录数最多，其次为腊实蝇属和寡鬃实蝇属；BOLD Systems数据库目前以COⅠ-5P标记的果实蝇属种类达61种，寡鬃实蝇属达70种，腊实蝇属55种，按实蝇属11种，绕实蝇属12种。

2 以PCR(polymerase chain reaction)为基础特异性扩增快速鉴定技术

2. 1 常规PCR技术

2. 1. 1 原理及特点 PCR，即聚合酶链式反应，由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年建立，是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的技术，其反应体系主要包括DNA靶序列、引物、4种dNTP、DNA聚合酶以及适合的缓冲液体系，由高温变性、低温退火、适温延伸3步为一个周期，循环进行，使目的DNA序列得以扩增(王廷华等，2005)。该技术操作快速简便、特异性强及灵敏度高，但是具有易被污染、易出现假阳性和假阴性等缺点。

2. 1. 2 国内外研究进展 余道坚等(2004)利用mtDNA COⅠ部分序列，通过对大量的实蝇基因序列进行分析比较，设计出2对特异性引物，应用定性PCR技术成功检测、鉴定了番石榴实蝇。崔俊霞等(2006)采用形态学观察与PCR技术相结合的方法，成功鉴定了从台湾水果中截获的疑似橘小实蝇的幼虫和蛹。王振华等(2008)采用PCR方法，利用ITS间断序列分型引物，根据扩增后片段的不同，区分橘大实蝇Bactroceraminax(Enderlein)与橘小实蝇。孔秋莲等(2010)利用特异的嵌套式引物对橘小实蝇18S rDNA基因片段进行扩增和序列比对分析，成功鉴定了柑橘果实中橘小实蝇的卵。

表1 实蝇DNA条形码的应用情况Table 1 The application of DNA barcoding for fruit fly identification

2. 2 Real-time PCR技术

2. 2. 1 原理及特点 Real-time PCR，即实时荧光定量PCR技术，于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃。所谓实时荧光定量PCR技术，即指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法(欧阳松应等，2004)。与常规PCR相比，它具有特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。目前该技术已得到广泛应用。

2. 2. 2 国内外研究进展 余道坚等(2006)基于mtDNA COⅠ设计引物，建立了SYBR Green实时荧光PCR技术快速鉴定辣椒实蝇Bactroceralatifrons(Hendel)的方法。Fengetal.(2007)基于mtDNA COⅠ，应用实时荧光定量PCR技术成功鉴定了三叶斑潜蝇Liriomyzatrifolii(Burgess)幼虫。徐浪等(2010)基于mtDNA COⅠ设计6条特异性引物，应用AllGlo实时荧光PCR方法成功鉴定了南美按实蝇Anastrephafraterculus(Wiedemann)、墨西哥按实蝇Anastrephaludens(Loew)、西印度按实蝇Anastrephaoblique(Macquart)、印加按实蝇AnastrephadistinctaGreene、中美按实蝇AnastrephastriataSchiner等6种重要的按实蝇。

2. 3 RFLP(restriction fragment length polymorphism)技术

2. 3. 1 原理及特点 RFLP，即限制性片段长度多态性技术，于1980年由Bostein建立并发展起来。它是指利用限制性内切酶酶解样品DNA从而产生不同长度的DNA片，进而通过电泳将不同长度的DNA片段分离出来(周延清，2005)。该技术具有多态性丰富、对基因组的覆盖范围比较广等优点，但存在成本昂贵、操作繁琐、检测周期长等缺点。

2. 3. 2 国内外研究进展 Muraji & Nakahara (2002)应用RFLP技术研究了亚太地区18种实蝇的快速鉴定方法，结果表明，除了杨桃实蝇BactroceracarambolaeDrew & Hancock和木瓜实蝇BactrocerapapayaeDrew & Hancock，该方法可准确鉴别其他16种实蝇害虫。吴佳教等(2004)研究表明，RFLP技术适用于橘小实蝇、锈实蝇Bactrocerarubigina(Wang & Zhao)、瓜实蝇Bactroceracucurbitae(Coquillett)、南瓜实蝇Bactroceratau(Walker)、具条实蝇Bactrocerascutellata(Hendel)及木姜子实蝇BactrocerahyalineShiraki等6种实蝇的快速鉴定。吴佳教等(2005)应用RFLP技术，对我国口岸截获频率较高的9种检疫性实蝇进行了快速鉴定。林丽莉等(2007)应用RFLP技术，对我国部分地区发生分布的蜜柑大实蝇Bactroceratsuneonis(Miyake)和橘大实蝇开展了分子生物学鉴定方法的研究并取得成功。Chuaetal.(2010)采用RFLP技术成功区分了杨桃实蝇和木瓜实蝇，进而使橘小实蝇复合种的有效识别得以实现。

2. 4 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)技术

2. 4. 1 原理及特点 RAPD，即随机扩增多态性DNA技术，由美国杜邦公司和加利福尼亚生物研究所在1900年提出(Welsh & McClelland，1990；Williamsetal.，1990)。它以一种或多种随机引物对模板DNA进行随机扩增，是建立在PCR基础上研究模板DNA多态性的遗传标记技术。其基本原理是利用人工合成的短核苷酸(大约10个碱基)对DNA靶序列进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳分离及溴化乙锭染色就可检测出DNA靶序列的多态性(温孚江，2002)。该技术具有操作简便易行、分析快捷方便、不用专门设计引物及引物数量不限等优点，但是存在稳定性差、重复性差、易出现假带等缺点。

2. 4. 2 国内外研究进展 Haymer & McInnis (1994)应用RAPD技术鉴定了地中海实蝇Ceratitiscapitata(Wiedemann)，认为RAPD技术可用于证明害虫同一种群和不同种群间的遗传变异。张红梅等(2004)利用RAPD技术对陕西省常见4种实蝇基因组DNA的多态性进行了初步研究。张亮和张智英(2007)采用RAPD技术鉴定了南瓜实蝇、黑漆实蝇Bactrocerascutellaris(Bezzi)、具条实蝇、瓜实蝇、橘小实蝇和番石榴实蝇等6种实蝇。

2. 5 AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术

2. 5. 1 原理及特点 AFLP，即扩增片段长度多态性技术，是一种基于PCR技术的选择性扩增限制性片段的方法，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后在限制性片段两端连接人工接头作为扩增的模板，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点(鞠秀芝等，2005)。该技术具有快速高效、多态性丰富、可靠性好等优点，但同时存在分析成本高、对样本DNA质量要求较高等缺点。

2. 5. 2 国内外研究进展 Kakouli-Duarteetal.(2001)采用AFLP技术准确区分了地中海实蝇和纳塔尔小条实蝇CeratitisrosaKarsch。我国暂无相关报道。

2. 6 基因芯片技术

2. 6. 1 原理及特点 基因芯片是生物芯片的一种，又被称作DNA芯片。其工作原理：经过标记的待测样本DNA与位于芯片上特定位置的探针杂交，根据碱基互补配对的原则确定靶DNA序列，最后经激光共聚集显微镜扫描，利用计算机系统对荧光信号进行比较和检测进而迅速得出所需信息(冯永强和阎小君，2000)。该技术具有快速高效、高通量、微型化以及自动化等优点，但同时存在技术复杂、成本昂贵、检测灵敏度低、重复性差及分析范围较窄等缺点。

2. 6. 2 国内外研究进展 李文芬等(2008)选择mtDNA COⅠ作为分子标记基因，建立了地中海实蝇、芒果小条实蝇Ceratitiscosyra(Walker)以及纳塔尔小条实蝇等实蝇科重要害虫的生物芯片检测方法。国外暂未发现相关文献。

3 问题与展望

近年来，分子生物学技术不断发展，其在昆虫分类中的应用也越来越广，这些技术不仅验证了传统分类所得出的结论，而且解决了传统分类所无法解决的疑难问题，均显示出分子生物学技术的优势及广阔的发展前景。

虽然分子生物学技术具有准确、客观等特点，即分子序列的信息代表遗传的本质，它不受物种个体发育阶段及环境条件等的影响，但同时存在许多问题。首先，从庞大的DNA文库中选择最佳、最能反映物种间进化关系的基因片段仍存在较大难度；其次，选择不同的目的基因研究同一物种，可能会得到不同的结果；再次，使用不同的分子生物学分析软件有可能得出不同的结果。这些问题是今后昆虫分类研究的重要课题。

崔俊霞, 徐瑛, 闻伟刚, 陈先锋, 张同心. 2006. 橘小实蝇快速检疫鉴定方法. 昆虫知识, 43(5): 731-733.

冯永强, 阎小君. 2000. 基因芯片技术. 国外医学: 分子生物学分册, 22(1): 1-5.

黄振. 2010. 果实蝇属重要种的鉴定、人工饲料筛选、适生性预测和风险分析. 海口： 海南大学.

黄振， 郭琼霞, 吴淇铭, 黄可辉. 2014. 番石榴果实蝇形态、危害与入侵中国的风险. 江西农业学报， 26(4): 61-63.

黄振, 黄可辉. 2012. 果蔬重要实蝇属的分布、危害与形态特征比较研究. 江西农业学报, 24(3): 73-75.

黄振, 梁军, 张旺珍. 2012. 我国首次截获检疫性有害生物——腿端黑实蝇. 植物检疫, 26(6): 94-99.

姜帆, 刘佳琪, 李志红, 吴佳教, 赵朔. 2011. 基于DNA条形码的广西苦瓜中实蝇幼虫分子鉴定研究. 植物保护, 37(4)： 150-153.

鞠秀芝, 杜胜利, 宗兆锋, 张桂华, 韩毅科, 王鸣. 2004. AFLP技术及其常见问题与解决方案. 天津农业科学, 10(4): 6-9.

孔秋莲, 叶军, 岳玲, 陈志军, 包英姿, 徐赟, 郭卡, 袁忠谊, 戚文元. 2010. 快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法研究. 华北农学报, 25(1): 226-230.

李文芬, 余道坚, 颜亨梅, 李建光, 徐浪, 任鲁风. 2008. 地中海实蝇及其近缘种基因芯片检测研究. 昆虫学报, 51(1): 61-67.

李志红, 吴佳教, 刘佳琪. 2011. 基于DNA条形码技术的泰国番石榴中实蝇幼虫分子鉴定研究. 植物检疫, 25(1): 49-52.

梁广勤, 梁帆, 赵菊鹏, 胡学难, 吴佳教. 2008. 中国实蝇检疫研究概况. 环境昆虫学报， 30(4)： 361-369.

林丽莉, 吴佳教, 曾玲, 梁广文, 胡学难, 莫仁浩. 2007. 二种大实蝇的PCR-RFLP快速鉴定方法. 昆虫知识, 44(16): 588-592.

刘慎思, 张桂芬, 武强, 张爱兵, 王进军, 万方浩. 2012. 桔小实蝇幼体及成虫残体DNA条形码识别技术的建立与应用. 昆虫学报, 55(3): 336-343.

欧阳松应, 杨冬, 欧阳红生, 马鹤雯. 2004. 实时荧光定量PCR技术及其应用. 生命的化学, 24(1): 74-76.

王廷华, 景强, Dubus P. 2005. PCR理论与技术. 北京： 科学出版社.

王振华, 冯汉利, 吕志藻, 赵晖, 郭明星, 朱堂明, 曾宪东, 陈建军. 2009. 实蝇类昆虫检测技术研究进展. 湖北植保, 112(2): 28-30.

王振华, 朱堂明, 吕志藻, 郭明星, 陈建军, 赵晖. 2008. 用PCR方法鉴定区分柑橘大实蝇与橘小实蝇. 植物检疫, 22(3): 155-157.

温孚江. 2002. 农业生物技术. 北京： 中国科学技术出版社.

吴佳教, 胡学难, 赵菊鹏, 梁帆, 梁广勤. 2005. 9种检疫性实蝇PCR-RFLP快速鉴定研究. 植物检疫, 19(1): 2-6.

吴佳教, 梁帆, 胡学难, 赵菊鹏, 梁广勤. 2004. 我国南方常见的6种寡毛实蝇PCR-RFLP快速鉴定研究. 江西农业大学学报, 26(5): 770-773.

徐浪, 余道坚, 李建光, 王银竹, 陈志粦. 2010. AllGlo实时荧光PCR快速检测6种按实蝇. 植物检疫, 24(5): 18-21.

余道坚, 邓中平, 陈志粦, 焦懿, 章桂明, 康林, 杨伟东, 金显忠. 2004. PCR法检疫鉴定番石榴实蝇. 植物检疫, 18(2): 73-76.

余道坚, 章桂明, 陈志粦, 康林, 杨伟东. 2006. SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定辣椒实蝇. 植物检疫, 20(1): 10-14.

张红梅, 潘亚勤, 魏迪功, 仵均祥. 2004. 陕西省常见四种实蝇的 RAPD 研究初报(双翅目: 实蝇科). 昆虫分类学报, 26(1): 59-63.

张亮, 张智英. 2007. 云南六种实蝇的RAPD快速鉴定. 应用生态学报, 18(5): 1163-1166.

周延清. 2005. DNA分子标记技术在植物研究中的应用. 北京： 化学工业出版社.

Abd-El-Samie E M and El Fiky Z A. 2011. Molecular phylogeny and identification of the peach fruit fly,Bactrocerazonata, established in Egypt.JournalofInsectScience, 11： 117.

Chua T H, Chong Y V and Lim S H. 2010. Species determination of MalaysianBactrocerapests using PCR-RFLP analyses (Diptera: Tephritidae).PestManagementScience, 66: 379-384.

Feng X, Chen N Z, Ma J, Zhu S F and Hu X N. 2007. Molecular identification ofLiriomyzatrifolii(Burgess) (Dipt., Agromyzidae) based on real-time PCR.JournalofAppliedEntomology, 131: 548-552.

Haymer D S and McInnis D O. 1994. Resolution of populations of the Mediterranean fruit fly at the DNA level using random primers for the polymerase chain reaction.Genome, 37: 244-248.

Hebert P D, Cywinska A and Ball S L. 2003. Biological identifications through DNA barcodes.ProceedingsoftheRoyalSocietyofLondon.SeriesB:BiologicalSciences, 270: 313-321.

Jiang F, Li Z H, Deng Y L, Wu J J, Liu R S and Buahom N. 2013. Rapid diagnosis of the economically important fruit fly,Bactroceracorrecta(Diptera: Tephritidae) based on a species-specific barcoding cytochrome oxidase Ⅰ marker.BulletinofEntomologicalResearch, 103: 363-371.

Kakouli-Duarte T, Casey D and Burnell A. 2001. Development of a diagnostic DNA probe for the fruit fliesCeratitiscapitataandCeratitisrosa(Diptera: Tephritidae) using amplified fragment-length polymorphism.JournalofEconomicEntomology, 94: 989-997.

Liang L, Jiang W and Yu H. 2011. Identification of ChineseBactroceraspecies through DNA barcoding (Diptera, Tephritidae).ActaZootaxonomicaSinica, 36: 925-932.

Lin C P and Danforth B N. 2004. How do insect nuclear and mitochondrial gene substitution patterns differ? Insights from Bayesian analyses of combined datasets.MolecularPhylogeneticsandEvolution, 30: 686-702.

Liu L, Liu J, Wang Q, Ndayiragije P, Ntahimpera A, Nkubaye E, Yang Q and Li Z. 2011. Identification ofBactrocerainvadens(Diptera: Tephritidae) from Burundi, based on morphological characteristics and DNA barcode.AfricanJournalofBiotechnology, 10: 13623-13630.

Muraji M and Nakahara S. 2002. Discrimination among pest species ofBactrocera(Diptera: Tephritidae) based on PCR-RFLP of the mitochondrial DNA.AppliedEntomologyandZoology， 37: 437-446.

Welsh J and McClelland M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.NucleicAcidsResearch, 18: 7213-7218.

Williams J G, Kubelik A R, Livak K J, Rafalski J A and Tingey S V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.NucleicAcidsResearch, 18: 6531-6535.