内皮细胞微粒与糖尿病血管病变

胡利梅，任卫东

（1.河北北方学院研究生部，河北 张家口075000；2.河北北方学院附属第一医院内分泌科，河北 张家口075000）

据流行病学调查，我国20岁以上的成年人糖尿病患病率为9.7%，其中血管病变是糖尿病严重并发症之一。血管内皮细胞具有维持血管的正常结构、功能及抗动脉硬化的作用，内皮损伤是血管病变的始动因素。内皮细胞在活化、损伤和 （或）凋亡时，会释放内皮细胞微粒 （endothelial microparticle，EMP）。EMP具有不同的生物学效用，包括促进动脉壁炎症反应、损伤内皮细胞、促血栓形成以及激活肾素－血管紧张素系统 （renin－angiotensin system，RAS）等。有研究证实EMP在血管疾病中具有促炎症反应作用，如动脉粥样硬化和糖尿病视网膜病变 （DR）［1－2］。现综述EMP与糖尿病血管病变研究状况进展。

1 EMP的组成

在损伤、缺氧或炎症刺激的过程中内皮细胞会释放EMP［3］，1990年 Hamilton等用钙离子载体A23187和补体蛋白C5b－9刺激脐静脉的内皮细胞，产生一种微粒，直径＜1μm，并第一次用流式细胞仪检测出该物质，命名为EMP。它被定义为直径为＜1μm的小囊泡，由磷脂、蛋白质和膜内容物 （核物质与部分细胞质）组成。

1.1 磷脂

所有真核细胞膜磷脂是不对称分布的，这种不对称分布的消失，往往会引起细胞膜的出芽与脱落，产生磷脂对称分布的微粒。许多激活剂会引起膜磷脂的对称分布，如胶原、凝血酶、钙离子载体A23187和补体蛋白C5b－9等，形成微粒。

1.2 膜内容物

膜内容物包括部分细胞质和核物质，微粒膜内有DNA、RNA、microRNA多种核物质，它们作用还有待进一步探索。Deregibus等［4］证实了EMP中的mRNA在转运至内皮细胞的过程中，通过增强内皮NO合酶的表达和激活蛋白激酶B（protien kinase B，PKB），促进血管生成，影响血管内稳态。

1.3 蛋白质

EMP表达许多成熟内皮细胞表面的特异性蛋白，如血小板内皮细胞黏附分子 （CD31）、细胞间黏附分子 （CD54）、E选择素 （CD62E）、p－选择素 （CD62P）、内皮因子 （CD105）、VE－钙黏蛋白 （CD144）以及内皮连接蛋白 （CD146），故通过标记这些特异性蛋白可检测EMP水平。而单一用CD31标记EMP，通常无法将EMP与血小板微粒 （platelet microparticle，PMP）区分开，因为白细胞和血小板也可表达CD31，但是CD42b仅在血小板及白细胞表面表达，而在内皮细胞表面不表达，所以采用双标记CD31表达阳性和CD42b表达阴性 （CD31＋／CD42b－）可将两者区别开，增加EMP检测的特异性及敏感性，故采用流式细胞术检测CD31＋／CD42b－标记的内皮细胞微粒。

2 EMP的检测

EMP是反应内皮细胞功能的一种新型标志物，根据EMP表型特征，可以测定血浆中EMP的含量，但目前尚未形成标准化检测EMP，2种常用的检测方法如下。

2.1 固相捕获法的ELISA

此方法可对EMP进行定性和定量的分析，目前已不常用。具体方法：在已捕获PSer＋微粒后的固定的锚定蛋白V中，通过加入内皮细胞抗原特异抗体 （如抗CD31、抗CD54、抗CD62E、抗CD62P、抗CD144等）对EMP进行分类，然后加入凝血因子 （如钙、Ⅱ、Xa、Va）产生凝血酶，而加入的PSer＋微粒和凝血因子的量与凝血酶的活性强度直接相关，可反映EMP的量。

2.2 流式细胞术

在流式细胞术中EMP被定义为直径为＜1.0μm的内皮特异性抗体阳性粒子。检测步骤：①用含有柠檬酸钠的真空采血管采集空腹静脉血2mL；②150g离心10min获血小板丰富血浆，1 000g离心2min获得去血小板的血浆 （platelet poor plasma，PPP）；③EMP分析：取50μL PPP与4μL PE标记CD31单抗及4μL FITC标记CD42b单抗混合并室温下避光放置20min，用0.5mL PBS缓冲液 （pH值7.2～7.4，NaCl 137mmol·L－1，KCl 2.7mmol·L－1，Na2HPO44.3mmol·L－1，KH2PO41.4mmol·L－1）稀释后，流式细胞仪进行分析。样本检测前以直径为1.0μm的标准微球于前向角定门，门内收集的微粒直径均＜1.0μm，EMP被定义为CD31＋／CD42b－的直径＜1.0μm的粒子。该检测方法简便而且相对精确，目前最为常用。

3 EMP在糖尿病血管病变中的作用

3.1 促炎症反应

糖尿病患者血管病变的发生、发展，伴随着慢性炎症反应，有多种促炎因子参与，如TNF、IL－18、IL－6，IL－1β等。EMP能够促进炎症反应的发生，而炎症反应通过炎症因子参与EMP的产生。高糖条件下，EMP通过增加NADPH氧化酶的活性，促进内皮炎症反应和损伤血管［5］。

3.2 内皮损伤

糖尿病患者微血管病变与毛细血管床和小动脉长期处于高血糖状态有关。Jung等［6］证实EMP与糖尿病并发症紧密相关，并且EMP的水平与性质体现了内皮细胞的功能状态。田刚等［7］发现EMP在持续血糖升高状态下，通过促进氧自由基与内皮素的产生，降低NF－κB的活性及一氧化氮的利用率，导致血管内皮功能受损，诱发糖尿病患者血管并发症的发生。

3.3 促血栓形成作用

糖尿病大血管病变过程中，持续高血糖加重了内皮功能的损害，导致EMP水平逐渐升高，增加EMP表面组织因子和磷酯酰丝氨酸的表达，促进凝血，导致缺血性血管病的发生。EMP表面巨大的vWF加速了血小板的聚集，并能够稳固已形成的血栓。同时EMP表面还表达许多其他的黏附分子，如ICAM－1、VCAM－1、PECAM－1、E－选择素、F选择素等，它们通过稳固EMP与血小板的连接，促进血栓形成。在高血糖、高血脂、氧化应激及慢性炎症等多因素作用下，逐渐加重糖尿病患者血管的病理改变，增加糖尿病患者血管狭窄、闭塞，甚至截肢的风险，同时增加了心血管事件发生的风险。

3.4 EMP与ROS的相互作用

慢性高血糖可激活RAS，升高血管紧张素I（angiotensin－I，Ang－I）和血管紧张素II（angiotensinⅡ，AngⅡ）的水平。Burger等［8］发现AngⅡ可刺激EMP产生，EMP通过刺激活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS）促进炎症反应发生，导致糖尿病动脉血管硬化。AngⅡ介导产生的血管内O2－主要来源于NADPH的氧化，它影响RhoA／Rho激酶活性，Rho激酶能够调节细胞骨架的形成，Rho激酶抑制剂可阻断AngⅡ刺激EMP的形成。故糖尿病患者早期应用AT1R受体阻滞剂，可以减缓动脉血管硬化的发生、发展。

4 糖尿病血管病变危险因素与EMP

4.1 高血压与EMP

在长期高血压的高剪切应力作用下，可加速内皮细胞损伤及EMP的产生，导致靶器官的损害。研究发现在2型糖尿病患者中，合并高血压的EMP水平高于无高血压组，并且与动脉硬化有关［9］。

4.2 吸烟与EMP

嗜烟与内皮祖细胞 （EPC）的改变和内皮功能不全密切相关，有致糖尿病动脉血管粥样硬化的作用。Heiss等［10］发现接触吸烟环境的志愿者体内EMP含量较暴露前明显升高，并且肱动脉血流介导的血管舒张反应 （FMD）较暴露前差；并且从体内提取并培养的EPC，能够减弱血管内皮生长因子 （VEGF）激发NO释放的反应。故吸烟引起的EPC与内皮功能不全可能与体内EMP水平升高有关。

5 展 望

综上所述，EMP与糖尿病血管病变有着密切联系，EMP不仅可以作为内皮细胞受损的标志，而且在炎性反应、内皮损伤、血栓形成等方面发挥一定作用，并且与高血压、吸烟等高危因素密切相关。因此它不仅是内皮受损或激活的标志，还在血管损伤的发病机制中发挥作用。由于EMP能够更加直接而特异地反映内皮细胞的功能状态，深入研究有可能为揭示内皮损伤性疾病的发病机制或提示病情发展提供据。EMP为血栓性疾病的发病机制及诊断方法提供新信息，可能有利于减少糖尿病患者致残、致死的发生。如何将EMP检测运用于临床等有待进一步研究。

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