色谱法在药物分析中的应用

2014-08-15沈爱平

黄冈职业技术学院学报 2014年3期

沈爱平

(黄冈职业技术学院医药卫生学院，湖北黄冈438002)

色谱法 (chromatography)是一种物理或物理化学分离分析方法，是将混合物中各组分分离后在线或离线分析的方法，是现代分离分析的一个重要方法。1901年，俄国植物学家茨维特首先认识到色谱法在分离分析方面的重要价值，并于1903年首先应用色谱法分离植物叶片中的各种色素。色谱法利用不同物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对移动时，这些物质在两相间进行反复多次分配，原来微小的分配差异产生了很明显的分离效果，从而依先后顺序流出色谱柱，通过适当的检测手段对分离后的各组分进行测定。色谱法具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点，是分析混合物的最有效手段。色谱法被广泛用于药品的鉴别、纯度检查和含量测定。

药物分析则是分析化学在药物研发领域中的应用分支。在药物研发领域，没有药物分析就没有新药的发现［1］。该学科涉及的研究范围包括药物质量控制、临床药学、中药与天然药物分析、药物代谢分析、法医毒物分析、兴奋剂检测和药物制剂分析、创新药物研究，以及药品上市后的评价等［2］。

1 薄层色谱法(Thin layer chromatography，TLC)

薄层色谱法(Thin layer chromatography，TLC)是将供试品溶液点样于涂布有固定相的薄层板上，经展开、检视后所得的谱图，与适宜的对照品按同法操作所得的色谱图进行比较，主要用于药品的鉴别及药品中杂质的检测［3］。薄层色谱法操作方便，分离效率高，专属性好，分析速度快，各国药典中均有多种药物采用TLC法来检查有关物质以保证药品的纯度。近年来，尽管其他色谱技术发展迅速，但薄层色谱的应用并没有明显减少［4］。

薄层色谱法可根据药物中杂质的不同情况，可采用不同的方法进行检查［5］:若杂质已知，则可采用杂质对照品法进行检查;若杂质的结构不能确定或无杂质的对照品，则可采用高低浓度对比法。毕雪艳［6］等采用薄层色谱法检测复方氨酚烷胺颗粒中有关物质(对氯苯乙酰胺)，以硅胶 GF254为固定相，以0.5% 的羧甲基纤维素钠溶液为粘合剂，展开剂为氯仿－丙酮－甲苯(13∶5∶2)。该法测得的对氯苯乙酰胺最小检出量为0.2 μg。张尊听等［7］建立了新型内标法以大豆甙元为内标物测定葛根素注射液、中药葛根及中成药玉泉丸中葛根素的含量，试验以甲醇－乙酸乙酯－石油醚－水(1.8∶6.0 ∶4.0 ∶0.35)为展开剂，测定结果准确，平均回收率为98.99%，RSD小于1.78%。

薄层色谱法优点:1.展开时间短，一般十至几十分钟。2.分离能力强，斑点集中。3.灵敏度高，通常几至几十微克的物质即可被检出。4.显色方便，可直接喷洒腐蚀性的显色剂，如浓硫酸等。5.所用仪器简单，操作方便，可以普及。6.薄层板价格低廉，一块板可同时检测多个样品。7.色谱直观性强。具有操作方便，设备简单，分离效率高，专属性好，分析速度快，色谱参数易调整等特点，在药物分析中应用较为广泛。

2 气相色谱法(Gas chromatatography，GC)

气相色谱法(Gas chromatatography，GC)是1952年创立的一种以气体为流动相的柱色谱法，是采用气体流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用数据处理系统记录色谱信号。由于气体粘度小，组分扩散速率高，传质快，采用高灵敏度的通用型检测器，使得气相色谱法具有选择性好、柱效高、灵敏度高、样品用量少、分析速度快等特点，但受样品蒸汽压限制，不适用于难挥发和热稳定性差的物质的分析。

李成等［8］建立气相色谱法测定复方达克罗宁薄荷脑润肤止痒水中薄荷脑含量，薄荷脑质量浓度线性范围为 0.3356 － 1.678 g/L。贺焕华等［9］建立的毛细管气相色谱法测定盐酸头孢吡肟中N－甲基吡咯烷杂质含量，N－甲基吡咯烷浓度在1.1213－134.56 μg/mL时线性关系良好，相关系数r=0.99998，RSD=0.00486%，加样回收率 101.73%，检测限 0.6 ng。刘敏等［10］采用 DB －17(30 m×0.53 mm，1μm)毛细管色谱柱建立毛细管气相色谱法直接测定扑米酮片中扑米酮的含量，扑米酮在0.096～4.8 mg/mL范围内线性关系良好(r=0.999 7)，平均回收率为 98.7%。

气相色谱法优点是:1.应用范围广，能分析气体、液体和固体。2.灵敏度高:可测定痕量物质，进样量可在1mg以下，一般气体样量为几毫升，液体样用几微升或几十微升。可作超纯气体、高分子单体的痕迹量杂质分析和空气中微量毒物的分析。3.选择性高:可有效地分离性质极为相近的各种同分异构体和各种同位素。4.效能高:可把组分复杂的样品分离成单组分。5.速度快:一般分析，只需几分钟即可完成，有利于指导和控制生产。6.应用范围广:即可分析低含量的气、液体，亦可分析高含量的气、液体，可不受组分含量的限制。

3 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)高效液相色谱是在经典液相色谱法的基础上发展起来的一种在线分离分析方法，采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高，选择性好和应用范围广等优点。它结合了液相色谱法和气相色谱法的分析分离原理，并且可以直接用于分析难挥发、热不稳定及高分子样品，弥补了气相色谱法的弱点，扩大了色谱法的应用范围。由于HPLC方法的诸多优点，使得该方法称为中国药典所有分析方法中发展最快的一种分析方法。由1985年版刚规定使用时的8个品种，发展到2000版药典的282个品种。高效液相色谱法包括吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法和分子排阻色谱法，其中基于分配机理的高效液相色谱法在药品检验中应用非常广泛的一种仪器分析方法。

朱莉萍等［11］建立高效液相色谱－荧光法(HPLC－FLD)检测猪肉中两种氟喹诺酮类药物，采用 ZORBAX－SB－C18 色谱柱，以乙腈、0.01 mol/L磷酸二氢钠(磷酸调 pH 3)为流动相，检测波长280 nm，发射波长450 nm。本方法测定动物组织中的恩诺沙星、环丙沙星的残留，检测条件稳定，加标回收率高，系数较小，可操作性强，应用简单方便。林祖武［12］建立了HPLC法测定苦参洗剂中苦参碱含量，苦参碱的进样量在0.12－2 μg/ml范围内与峰面积积分值呈良好线性关系，平均回收率为98.03%，RSD为 1.36%，方法简便可行准确，且可操作性好。赵军等［13］建立了反相高效液相色谱法同时分离测定6种临床最常用的头孢菌素(头孢他啶、头孢拉定、头孢氨苄、头孢哌酮、头孢唑林、头孢噻肟)，采用 SHIM－PACK VP－ODS(150×4.6mm I.D.)色谱柱，以乙腈及 0.05 mol/L HAC－NaAC缓冲溶液(pH=4.0)组成流动相梯度淋洗，在 15 min内分离并测定了上述6种头孢菌素，6种药物最低检出限均可达到 0.20 μg/mL。

高效液相色谱法主要优点是:1.分辨率高于其它色谱法。2.速度快，十几分钟到几十分钟可完成。3.重复性高。4.高效相色谱柱可反复使用。5.自动化操作，分析精确度高。

4 色谱联用技术

4.1 色谱－质谱联用

色谱－质谱联用结合了色谱高分离能力和质谱高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体，使样品的分离、定性及定量成为连续的过程，是一种高效能、高选择性、高灵敏度的分离分析方法。在药物分析中的应用越来越广泛。色谱－质谱联用分为气相色谱－质谱法(gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS)和液相色谱－质谱法(liquid chromatography－mass spectrometry，LC－MS)。GCMS对可挥发性未知成分与微量成分的结构分析具有明显优势。但是由于GC法的局限性，使得GCMS难以用于极性、热不稳定和大分子化合物的测定。陈琴华等［14］不仅分析了 GC－MS灵敏度的影响因素，还通过大量的文献总结了 GC－MS在体内化学药物分析、滥用药物分析及兴奋剂检测中的应用。

朱全红等［15］建立 GC－MS测定6名健康志愿者单次口服麻黄汤后尿液中麻黄碱类代谢产物的浓度，去甲伪麻黄碱(NMP)、去甲麻黄碱(NME)、麻黄碱(E)、伪麻黄碱(PE)和甲基麻黄碱(ME)在24h内达到良好分离，5种麻黄生物碱的回收率均在88.74%－102.70%之间，日内和日间精密度均≤10%。陈吉汉等［16］建立了超高效液相色谱－串联质谱法(UPLC－MS)测定鸡肉与鸡蛋中6种他汀类药物残留量。色谱柱为 BEH C18，以甲醇－0.1%甲酸5mmol乙酸铵为流动相，梯度洗脱分离，6 种他汀类药物在 1.0－100 μg/kg浓度范围内线性良好，r＞0.9910，检出限和定量限分别为 0.1－0.5 μg/kg 和 0.3－2.0 μg/kg。实际上，联用技术还带来许多无形的利益，包括减低成本。现代GC/MS的分离度和分析速度、灵敏度、专属性和通用性，至今仍是其他联用技术难以达到的。因此，只要待测成分适用于GC分离，GC/MS就成为联用技术中首选的分析方法。

4.2 色谱－核磁共振波谱联用

液相色谱－核磁共振联用(LC－NMR)出现于1978年，是快速分离、确定结构的强有力的药物分析手段。现已广泛应用于有机小分子药物的鉴别定量，生物大分子类生化药物的结构研究、药物的体外评价与研究及体内药物的监控与研究等。

王映红等［17］用停止流动的方法，对混合物的各个组分进行分离，并获得1H NMR及COSY谱，建立了用高效液相－核磁共振联用技术(HPLCNMR)检测微量级蛇葡萄根提取物中混合组分结构的方法，通过与此类化合物所建立的氢谱数据库进行比较分析，确定了微克级的天然产物混合物中的主要组分的化学结构及立体结构，使微量天然混合物中的主要组分的化学结构及立体结构得到证实，充分体现了HPLC－NMR技术的微量、快速的特点。杨春等［18］用高效液相色谱－核磁共振(HPLC－NMR)联用技术中的连续流动和停止流动两种模式对萘哌地尔中杂质进行检测，将萘哌地尔样品用乙腈溶解为浓度5 g/L。高效液相色谱的分析柱采用 Inertsil ODS－3 柱(4.6 I.D.×250 mm，5μm)。连续流动的进样量为20μL，停止流动的进样量为 50μL。检测器为 Varian Prostar－330二极管阵列检测器，紫外检测波长为210 nm。HPLC分离条件为乙腈 ∶磷酸缓冲溶液=65∶35(pH7.8－8.0)。所有的图谱均在 INOVA－500核磁共振仪上完成。根据1HNMR，1H－1HCOSY谱完成了主要杂质1－萘环－丙三醇结构鉴定。

LC－NMR的特点不仅是LC的高效分离能力和NMR精确的结构分析能力，更体现在两者的有机结合。特别是当前超低温探头技术、微探头技术、流动抑制技术使LC－NMR的应用在药物分析中更加深入广泛。

5 结语

随着技术水平和新型仪器水平的不断提高，色谱法成为各国药典中发展较快的药物分析方法。在药物质量控制、天然药物及中成药分析、生物制品分析、药物代谢分析、药物制剂分析等诸多领域里，具有广泛的应用价值。根据待测样品的性质、检测要求等可采取不同的色谱法:如薄层色谱法，主要用于有关物质的检测以保证药品的纯度。气相色谱因待测物质需要气化，因此适用于易挥发、对热稳定的样品。高效液相色谱法对样品要求较低、选择性好、灵敏度高，其检出限低。因此，它是当前应用最为广泛的药物分析方法。

目前各学科间各种技术的相互渗透，不断涌现出各种新颖的色谱方法，并朝着微量化、自动化、联用化方向发展，尤其是色谱联用技术的发展，更加拓展了色谱法的深度，更加扩大了色谱法的检测范围，因而在医药研究领域里，其使用范围将更加广泛，也更具有现代科学意义。

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