HPLC法测定人血浆中异烟肼、吡嗪酰胺浓度

陆 磊，王 洁，丁红梓，周秋云，钱智磊，张 亮

0 引言

我国是全球22个结核病高负担国家之一，世界卫生组织估计，目前我国结核病年发病例数约为130万，位居全球第二位[1]。同时，我国也是全球27个耐多药高负担国家之一[2]。虽然我国在遏制结核病蔓延和流行的实际工作中取得了初步成效，但是要顺利实现我国结核病防治规划目标，仍然面临着诸多挑战[3]。

异烟肼(Isoniazid，INH)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)是用于结核病患者初始治疗的重要用药，大部分患者都可以获得很好的治疗效果[4]。PZA与INH化学结构相似，故可能通过与INH相似的机制破坏肝细胞。有报道，应用INH产生肝毒性的患者联合应用利福平和PZA后将出现更严重的肝损害[5]。INH和PZA的极性相差较小，使用同一流动相同时测定INH和PZA的方法相对简单，本实验室建立了同时测定这两种药物血药浓度的方法，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 高效液相色谱系统(日本岛津LC-10A)，包括SCL-10AVP系统控制器、LC-10ADVP溶剂输送泵、FCV-10ALVP混合器、DGU-14A脱气机、SPD-10AVP紫外-可见检测器、CTO-10ASVP柱温箱、CLASS-VP6色谱工作站；涡旋仪(大龙兴利)；分析天平(FB224，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；酸度计(PHS-3C，上海雷磁)；高速离心机(TG-1650，上海卢湘仪)；艾本德微量移液器(Eppendor，德国)。

1.2 试剂 INH对照品(批号：100578-200401、中国药品生物制品检定所)；PZA对照品(批号：100178-200403，中国药品生物制品检定所)；甲醇、乙腈(Merck公司，德国)均为色谱纯；磷酸二氢钾、三乙胺(国药集团，中国)均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱：CLC-ODS(岛津，日本，6 mm×150 mm)；柱温：37 ℃；检测波长：268 nm；流动相：0.05 mmol/L磷酸二氢钾(三乙胺调pH=5.6)∶乙腈=96∶4；流速：1 mL/min。

2.2 样品前处理 精密吸取血清300 μL，置于离心管中，加入700 μL甲醇，放置于涡旋混合仪上混合5 min，以13 000 r/min离心10 min，取上清液20 μL进样。

2.3 方法特异性 按“2.2”项下方法，处理人空白血浆、对照品溶液+人空白血浆及同时服用INH和PZA的患者血浆。结果INH和PZA的保留时间分别为8.283 min和11.025 min，两者峰形良好，与杂质峰分离完全。色谱图见图1。

图1 色谱图

2.4 标准曲线 取INH和PZA标准液加入空白血浆，使血浆中INH和PZA浓度为0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2 mg/L。按“2.2”项下操作，同法处理血浆。以峰高外标法定量，以浓度对峰面积作直线回归，最低检测浓度为0.3 mg/L，见表1。

表1 INH和PZA标准曲线和线性关系结果(n=6)

2.5 回收率 配制低、中、高浓度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血浆样品，每一浓度做平行管3份，按“2.2”项下方法操作进样，重复进样6次，记录峰面积，按回归方程计算浓度，与标准浓度比较得回收率，结果符合要求，见表2。

表2 加样回收率测定结果(n=6)

2.6 精密度 配制低、中、高浓度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血浆样品各6份，每一浓度做平行管3份，按“2.2”项下方法操作进样，分别于同日和3 d内测定，计算日内、日间RSD。精密度符合要求，结果见表3。

表3 日内、日间精密度计算结果(n=6)

2.7 稳定性 配制低、中、高浓度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血浆样品，每一浓度做平行管3份，于室温(20～30 ℃)放置0、4、8 h后，测定血浆样品浓度，每个样品重复测定6次；再取高、中、低浓度的INH和PZA的血浆样品，于-20 ℃放置7、14 d后，测定血浆样品浓度，每个样品重复测定6次。结果表明，样本在室温8 h、反复冻融3次和在-20 ℃放置14 d的条件下保持稳定。

3 讨论

3.1 样品前处理 通过固相萃取、液-液萃取、吹干复溶等样品前处理方法的比较，最后选择甲醇沉淀后直接进样的方法，该方法较固相萃取法成本大大降低，同时具有较高的回收率，而采取吹干复溶法虽然可以提高检测灵敏度，但其耗时且费用较高，不利于临床广泛开展。在比较甲醇和乙腈沉淀蛋白的效果后，发现乙腈虽在1∶1用量时具有很好的沉淀效果，但由于流动相中使用乙腈，进样时会造成色谱图形变化，产生拖尾、偏峰。

3.2 流动相选择 本实验室在测定单组分异烟肼时使用0.05 mmol/L磷酸二氢钾(三乙胺调pH=5.6)∶乙腈=98∶2[6-7]，该比例可以满足同时测定INH和PZA，但测定时间超过15 min，通过多次尝试后发现，将磷酸二氢钾和乙腈比例调整至96∶4时，既可以避免血浆中杂质峰干扰，又能将吡嗪酰胺的出峰时间前移约4 min，节约测定时间。

3.3 检测方法评价 该方法相较于单次测定每种抗结核药的血药浓度，可以节约1/2的成本和时间，同时具有很好的稳定性和重现性，通过与单独测定相同样本INH和PZA的血药浓度比较，该方法结果可靠，可以用于临床样本检测。

参考文献：

[1] World Health Organization.Global tuberculosis control:WHO report 2010.WHO/HTM/TB/2010.7.Geneva:WHO,2010.

[2] Stop TB Partnership.Global MDR-TB&XDR-TB response plan.2007-2008[M].Geneva:World Health Organization,2007:19.

[3] 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组,全国结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国肺结核患病率现况调查[J].中华结核和呼吸杂志,2012,35(9):665-669.

[4] 田洪英,王洪星,姚明.抗结核药血药浓度监测及临床疗效与安全性分析[J].中国药房,2012,23(26):92-94.

[5] Saukkonen JJ,Cohn DL,Jasmer RM,et al.An official ATS statement:hepatotoxicity of antituberculosis therapy[J].Am J Respir Crit Care Med,2006,174(8):935-952.

[6] 许亦鸣,陈冰,王洁,等.高效液相色谱法测定人血浆中异烟肼及乙酰异烟肼浓度[J].中国药房,2005,16(13):41-43.

[7] 杨书华,王洁,朱文玉,等.难治性结核性胸腔积液中异烟肼浓度的检测和对比[J].临床肺科杂志,2013,18(3):54-55.