化浊通脉散对ASO家兔ICAM-1指标表达的影响

李慎贤，吴 迪，程 磊，陈苏宁，金钟太，胡 莹

0 引言

下肢动脉硬化闭塞症(ASO)是一种常见病、多发病，为退行性病变，是大、中动脉硬化的基本病理过程。主要是细胞纤维基质、脂质和组织碎片的异常沉积，在动脉内膜或中层发生增生的过程中的复杂病理变化。近年来，ASO发病呈现明显的增高趋势。研究表明，中医药在治疗ASO方面有独特优势，体现了中医的整体观、因人制宜、组方灵活、副作用小的特点[1]。笔者观察化浊通脉散对实验性ASO家兔模型的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 新西兰雄性白兔50只，10月龄，体重2.8～3.0 kg，由我院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(辽)2009-0002。化浊通脉散组成：黄芪、金银花、胆星、半夏、茯苓、白术、泽泻、焦山楂、川芎、延胡索、水蛭，由三九药业集团提供，批号：0807021。通塞脉片，由江苏南星药业有限公司提供，批号：120509。西洛他唑片，由浙江大冢制药有限公司提供，批号：120708T。胆固醇：由国药集团化学试剂沈阳有限公司提供，批号：20120120。牛血清白蛋白注射液：由北京奥博星生物技术有限责任公司生产，批号：20120106。

主要试剂：Triozol Reagent，美国Invitrogen Life technologies公司；引物合成，北京华大基因公司；荧光定量PCR试剂盒，大连宝生物。血脂系列试剂由我院生化室提供。

主要仪器：德国eppendorf5417R离心机，雅培ARCHITECTci8200全自动生化免疫分析仪，小型台式离心机(美国SIGMA，1-13)，高速冷冻离心机 sigma 31k5C型，美国PCR扩增仪(德国Biometra)，紫外分光光度计(英国UV-visible Spectrometer，UV300)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物选择及分组 选用健康纯种新西兰雄性白兔50只，10月龄，体重2.8～3.0 kg。实验前适应性喂养1周，排除饮食异常者。1周后随机分为5组，每组10只：正常组、模型组、化浊通脉散组、通塞脉片组、西洛他唑组。

1.2.2 造模 正常组喂养普通饲料，自由饮水。其余4组自实验开始喂高脂饮食，每只每日在正常饲料中加胆固醇1 g、猪油5 g。第3天开始，均在10%乌拉坦麻醉下由左侧股动脉插管，4F气囊导管拖拉右侧髂股动脉8次，造成机械性内膜损伤[2-3]。实验第7天，模型组、实验组、对照组经耳缘静脉一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg造成免疫性内皮损伤；正常组注射等量生理盐水。至20周末，动物模型出现室内放行时后腿拖拉或跛行，表示造模成功。

1.2.3 药物治疗 从21周开始至24周末，各组改为正常饮食，开始进行药物干预。中药治疗组予化浊通脉散，按生药7.2 g/(kg·d)，用量按70 kg成人用量3.3倍计算；中药对照组予通塞脉片0.75片/(kg·d)，按60 kg体重成人每日用量20片计算；西药对照组予西洛他唑片4.5 mg/(kg·d)，按60 kg体重成人的人兔体表换算公式计算，均混入饲料中喂养。

1.2.4 取材及实时荧光定量PCR检测ICAM-1 mRNA相对表达量 取材：实验结束后，将动物用乙醚麻醉，解剖切取股动脉血管多段，长约0.2～0.3 cm，放到盛有1 mL Trizol的1.5 mL EP管中保存，制备实验标本，然后处死动物。

液体配制：①DEPC水：吸出1 mL，放于1 000 mL双蒸水中配成1‰ DEPC水，放于1 000 mL容量瓶中静置4 h备用。②75%乙醇：无水乙醇+DEPC水，放于-20 ℃保存(DEPC水需先高压)。

引物设计：目的基因RealTime PCR检测引物，设计引物见表1。

表1 引物设计

操作步骤：参照Trizol说明书采取一步法提取总RNA。采用紫外可见分光光度计测定260、280 nm的OD值，二者比值在1.8～2.0之间，逆转录合成cDNA。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。应用ABI 7500 扩增仪进行PCR扩增。反应条件：95 ℃ 0.5 min，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，1个循环。通过测定荧光强度而对PCR产物定量。

2 结果

根据RT-PCR原始检测结果，仪器可自动按设定的分析方法计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于正常组目的基因mRNA转录水平的差异-2-△△ct值，见表2。各组中ICAM-1的mRNA相对表达量见图1。由图1可见，B、C、D、E组的ICAM-1 mRNA表达水平高于A组(P<0.01)，C、D、E组的ICAM-1 mRNA表达水平低于B组(P<0.01)，D、E组的ICAM mRNA表达水平高于C组(P<0.01)。ICAM-1、GAPDH的扩增曲线和溶解曲线见图1。结果表明，PCR的扩增效率及产物特异性均高，排除了非特异性产物的干扰。

表2 各组对ICAM-1 mRNA表达的影响

图1 ICAM-1 mRNA的相对表达量

3 讨论

下肢动脉硬化闭塞症属中医“脉痹”、“脱疽”[4]、“血癖”范畴，在古典文献中多有记载。中医学认为，本病与饮食失节、脏腑亏虚、经脉痹阻等有密切关系[5]。饮食失节，膏粱厚味，损伤脾胃，湿浊内生，痰癖互结，阻塞经脉；或因气血亏虚，运行无力，脉络癖阻，气虚血癖，经脉痹阻，气血不达四末而发为“脉痹”。或因肝肾亏虚，气竭精伤，肾水消灼，筋练骨枯，而成“脱疽”之症。气血淤滞不通、肢体失荣是其标，脾失健运、痰湿脂浊壅积、阻滞经脉是其本。本研究遵循“治病务求其本”的原则，以化痰健脾、益气通脉为治疗方法，组成化浊通脉散(黄芪、川芎、水蛭、金银花、胆南星、半夏、茯苓、白术、泽泻、焦山楂、延胡索)。此方从中医角度加强了古方的活血化瘀、化浊通脉作用，从西医方面加强了古方抗凝血、抗血栓形成、降脂及抑制血管内壁动脉硬化斑块形成的作用。重用黄芪：补气，使气旺则血行，瘀消而不伤正，为君药。川芎、水蛭：活血祛瘀，为臣药。胆南星、半夏：祛痰泄浊通络；泽泻：利水渗湿；焦山楂：消痰化瘀；金银花：清热解毒；延胡索：行气止痛，行血中之气，又能行气中之血。以上共为佐药。全方共同组成益气化瘀通络、健脾祛痰化浊之功。

研究表明，黄芪能抑制血小板粘附，消除自由基，减少过氧化脂质，稳定细胞膜，增强机体非特异性免疫功能[6-9]。金银花具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗血小板聚集、降低胆固醇、抗氧化等作用[10]。白术能增强机体清除自由基的能力，具有明显的抗氧化作用。川芎对血管内皮细胞有保护作用，对血管平滑肌细胞增殖有抑制作用，可改善血液循环，调节血脂。半夏有降压作用。茯苓可抗氧化、抗炎、提高免疫力[11]。泽泻具有降低血脂、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、抗血栓形成及增强纤溶酶活性等作用，能从降低血脂、抑制内皮细胞损伤、抗血栓等多个方面抑制或减轻动脉粥样硬化的发生、发展[12]。水蛭具有抗凝、抗血栓、保护内皮细胞及抗炎的作用，研究表明，水蛭中的水蛭素是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂[13]。胆南星可镇痛，研究表明，5%胆南星水溶液的镇痛率为90.91%[14]。焦山楂有降血脂的作用[15]。延胡索中的生物碱具有很强的镇痛、降压的作用，四氢黄连碱对二磷酸腺苷、花生四烯酸和胶原诱导的兔血小板聚集均有抑制作用[16]。以上药理学研究表明，此方从降低血脂、抗氧化消除自由基、抗凝血、抗血栓形成、抗炎、增强纤溶酶活性、保护血管内皮等方面发挥作用，可改善下肢血液循环，抑制血管内壁动脉硬化斑块的形成。本研究结果表明，化浊通脉散可以起到防治ASO的目的。

研究认为，高脂血症是下肢动脉硬化闭塞症的一种危险因素[17]，本研究亦证实了此观点。TC、TG、LDL过高都是下肢动脉硬化闭塞症的危险因子。LDL是致动脉粥样硬化的基本因素，其通过血管内皮进入血管壁内，在内皮下滞留的LDL被修饰成氧化型LDL(ox-LDL)，ox-LDL不能被正常LDL受体识别，而被巨噬细胞的清道夫受体识别而快速摄取，巨噬细胞吞噬ox-LDL后形成泡沫细胞，后者不断地增多、融合，构成了动脉粥样硬化斑块的脂质核心。ox-LDL可刺激机体产生大量的黏附分子、化学趋化分子、细胞因子、生长因子和细胞毒素等，进一步促进了动脉粥样硬化的发生、发展[18]。而HDL能移除外周组织的胆固醇，转运给肝脏进行分解代谢。也有研究提示，HDL还可能通过抗炎、抗氧化和保护血管内皮功能而发挥其抗动脉粥样硬化作用，具有防治动脉粥样硬化发生、发展的作用。研究表明，化浊通脉散虽对HDL作用不明显，但对TG、LDL有较明显的抑制作用，亦减轻了以上LDL促动脉粥样硬化的作用，说明化浊通脉散可通过减低血脂来抑制动脉粥样硬化形成和发展。

现代医学认为，动脉硬化病变是从受累动脉的内膜开始，近年来多数学者支持内膜损伤炎症反应学说，认为完整的内皮细胞是动脉的生理屏障，基于其扩血管、抗凝、抗血小板、抗脂质沉积和抗缩血管物质的综合作用，才能够保证血液的正常流动，防止血栓和AS的形成。如果内皮细胞遭受广泛和严重的损害，就会出现与之相反的病理生理变化。ICAM-1是免疫球蛋白超家族的成员，在中性粒细胞迁移和内皮细胞粘附导致动脉硬化过程中起重要作用[19]。正常内皮细胞中ICAM-1表达很低，炎症反应开始时，多种炎性介质及细胞因子刺激内皮细胞，使ICAM-1等表达增加[20-22]，白细胞通过内皮细胞跨膜游出，趋向炎症灶，大量单核细胞粘附于损伤内皮表面，并跨过内皮层进入内皮下基质，吞噬大量脂质，变为激活的巨噬细胞，最后成为泡沫细胞[23]。ICAM-1还介导淋巴细胞聚集在损害部位，导致斑块内炎细胞浸润增加，通过分泌各种水解酶导致斑块不稳定[24]。在动脉硬化斑块的发生、发展中起关键作用。ICAM-1是ASO早期的病理变化的促进因素，并与其严重程度有关[25]。

综上所述，化浊通脉散可有效降低ICAM-1在血管内皮细胞上的表达，因此可有效防治动脉硬化斑块的形成与发展。

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