丹参酮ⅡA、苦参碱、川芎嗪对PC12细胞抗肿瘤活性的研究

马 辉，范 青*，胡增春，胡慧敏，吕慧怡，程荔春，何玉芳，张 策，郝堂娜

0 引言

PC12细胞是从大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆的细胞系，主要分泌产物为儿茶酚胺类递质，包括多巴胺、去甲肾上腺素等。因其具有可传代培养的特点，作为神经元细胞模型，广泛用于神经生理、病理及药理方面的研究，有助于阐明神经系统疾病的发病机制、药物疗效，探索新的药物与治疗手段[1]。

丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TanⅡA)是丹参酮脂溶性成分的代表，药理作用极其广泛，包括抗氧化、抗炎、心肌保护、抗肿瘤等作用[2]。近年来，国内外学者对其抗肿瘤作用较为关注，发现TanⅡA对多种肿瘤细胞具有细胞毒性作用，能抑制肿瘤细胞增殖，可诱导肿瘤细胞分化和凋亡[3-4]。苦参碱(Matrine，Mat)作为一种传统的中药成分，在抗炎、抗心律失常方面有重要的应用价值。同时，苦参碱具有较广的抗瘤谱，对多种肿瘤细胞株及移植瘤有较高的抑制率[5-7]。川芎嗪(Ligustrazine，LZ)系从传统中药川芎中提取出来的有效生物碱成分，近年来，川芎嗪的抗肿瘤作用备受国内外研究者的关注，主要作用：逆转肿瘤细胞多药耐药(MDR)、免疫肿瘤、放疗增敏、化疗增效、抗肿瘤转移[8]。

大量文献表明，丹参酮ⅡA、苦参碱、川芎嗪均有抗肿瘤活性，并且具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。其中，川芎嗪能抑制MDA-MB-231细胞的体外增殖，且抑制作用表现为时效和量效关系；并能通过阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制乳腺癌细胞凋亡。苦参碱对人脑胶质瘤BT325细胞具有明显的增殖抑制和促进凋亡的作用[9]。丹参酮ⅡA 能够显著降低人胶质瘤细胞系U87迁移作用[10]。本试验主要研究丹参酮ⅡA、苦参碱、川芎嗪对于PC12细胞的抗肿瘤活性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 PC12细胞来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，由大连医科大学病理教研室提供，广泛用于神经系统疾病的体外研究。-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.1.2 主要试剂 川芎嗪(南京泽朗医药科技有限公司)、丹参酮ⅡA(西安保赛天然产物科技有限公司)、苦参碱(西安保赛天然产物科技有限公司)；胎牛血清(Hyclone公司)、PBS(北京中杉金桥公司)、DMEM(北京艾然生物科技有限公司)、MTT(北京索莱宝科技有限公司)、DMSO(Hyclone 公司)、NaHCO3(北京中杉金桥公司)、双抗(青霉素及链霉素溶液，Hyclone 公司)、胰酶(美国Sigma)。

1.1.3 主要仪器 CO2恒温培养箱(美国Thermo)，台式高速冷冻离心机(美国Sigma)，酶标仪(美国Sigma)，电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，超净工作台(苏净集团安泰公司)，倒置式生物显微镜(中国XD-101)，自动涡旋混合器(天津药典标准仪器厂)，溶剂过滤器(天津药典标准仪器厂)，恒温水浴箱(江苏荣华仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏与培养 根据细胞的复苏“慢冻快融”的原则：取出冻存的PC12细胞株，迅速放入37 ℃恒温水浴箱内，将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化，立即加入到配制好的DMEM培养基，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后换液1次，连续传代至对数生长期。

1.2.2 溶液的制备 丹参酮ⅡA溶液的制备：精密称取丹参酮ⅡA 50 mg溶于6 mL DMSO中，得8.33 mg/mL的母液，用DMEM培养液稀释得到浓度为20 μg/mL的溶液。置4 ℃冰箱中备用。苦参碱溶液的制备：精密称取苦参碱12.8 mg溶于4 mL DMEM培养液中，得到浓度为3.2 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱中备用。川芎嗪溶液的制备：精密称取川芎嗪12.8 mg溶于4 mL DMEM培养液中，超声使其溶解，得到浓度为3.2 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱中备用。MTT溶液的制备：精密称取MTT 40 mg，用8 mL PBS溶解，得到浓度为5 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱中避光保存。

1.2.3 细胞计数 ①盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血细胞计数槽上。②制备计数用的细胞悬液：用吸管吸取细胞悬液、锥虫蓝染液(0.4%)各1滴，吹均匀。③将细胞悬液滴入计数板：吸取少量吹匀的细胞悬液沿盖片边缘缓缓滴入，至盖玻片下充满悬液。④统计4个大格的细胞数：将血细胞计数板放于显微镜的低倍镜下，观察计数。⑤计算原细胞悬液的细胞数：按照下面公式计算细胞密度：细胞悬液的细胞数/mL=(4个大格子细胞数/4)×2×105。计算出细胞密度为9.28×106个/mL。

1.2.4 细胞铺板 取对数生长期细胞，用胰酶溶液(0.25%胰酶∶0.02%EDTA=1∶1，v/v)消化。将上述溶液用培养基稀释，使细胞悬液的细胞密度为9.28×106个/mL，分别取100 μL接种于96孔板中，孵箱中培养24 h。

1.2.5 MTT法测定[11]37 ℃培养后，弃上清液，加入待测药物，于37 ℃、5%CO2孵箱中培养24 h，弃上清液，加入含0.2 mg/mL MTT的无血清培养基后，继续培养4 h，弃上清，并加入20 μL DMSO溶解MTT甲臜沉淀，置摇床上低速振荡15 min，使结晶物充分溶解，混匀。在酶标仪492 nm处测量各孔的吸光度值A。抑制率=(A对照组-A给药组)/A对照组×100%。

1.2.6 体外药效学实验 用培养基将丹参酮ⅡA稀释至浓度分别为：67.95、33.98、16.99、8.49、4.25、2.12、1.06、0.53、0.27 nmol/mL。用培养基将苦参碱稀释至浓度分别为：12.89、6.44、3.22、1.61、0.81、0.40、0.20、0.10、0.05 μmol/mL。用培养基将川芎嗪稀释至浓度分别为：23.50、11.75、5.87、2.94、1.47、0.73、0.37、0.18、0.09 μmol/mL。

按照MTT法，测量各孔的吸光度值A，计算其抑制率，并用Origin软件计算IC50值。每个浓度3个样本，比较3种药物的IC50值，从而比较其抗肿瘤活性。

2 结果

2.1 细胞形态观察

2.1.1 丹参酮ⅡA对细胞形态的影响 PC12细胞经丹参酮ⅡA处理后，细胞凋亡情况见图1。如图1所示，与对照组相比，低浓度丹参酮ⅡA对细胞增殖有抑制作用。0.27 nmol/mL丹参酮ⅡA处理细胞后，胞体折光性好，突起明显；当用浓度为16.99 nmol/mL丹参酮ⅡA作用于PC12细胞时，显示典型的凋亡细胞形态学特征，核仁减少、固缩，折光性降低，核内异染色质明显增多，并沿核膜边沿聚集，胞质内充满大小不等的空泡；当丹参酮ⅡA浓度达67.95 nmol/mL时，细胞变圆离壁，突起减少，固缩，颗粒明显增多，部分细胞涨大破裂。

图1 丹参酮ⅡA对细胞形态的影响

2.1.2 苦参碱对细胞形态的影响 PC12细胞经苦参碱处理后，细胞凋亡情况见图2。由图2可见，与对照组相比，0.05 μmol/mL苦参碱处理细胞后，细胞形态好，胞体折光性好，突起明显；苦参碱浓度达3.22 μmol/mL时，细胞固缩，突起减少，胞浆内可见有颗粒，折光性减弱；当苦参碱浓度达12.89 μmol/mL时，细胞轮廓变模糊，变圆离壁，突起减少，变短，胞浆内颗粒明显增多。

图2 苦参碱对细胞形态的影响

2.1.3 川芎嗪对细胞形态的影响 PC12细胞经川芎嗪处理后，细胞凋亡情况见图3。如图3所示，与对照组相比，川芎嗪浓度<0.09 μmol/mL时，细胞形态无明显变化，轮廓清晰，胞体折光性好，细胞突起明显；11.75 μmol/mL川芎嗪作用于PC12细胞24 h后，即对其细胞增殖有抑制作用，细胞突起减少，细胞折光性减弱，胞浆内可见有颗粒；川芎嗪浓度达23.50 μmol/mL时，细胞轮廓变模糊，细胞变圆离壁，变短，部分细胞涨大破裂。

2.2 各给药组IC50值比较 各给药组IC50值结果见表1。细胞生长曲线见图4，由图4可知，这3种药物不同浓度时，都能有效抑制PC12细胞的增殖，且细胞生长率随着药物浓度的增加而增大。当丹参酮ⅡA的药物浓度≤0.27 nmol/mL时，药物对细胞的抑制作用不明显；随着药物浓度的增加其抑制作用增强，当药物浓度达23.21 nmol/mL时，其抑制率达50%。当苦参碱的药物浓度≤0.05 μmol/mL时，药物对于细胞的抑制作用不明显；当药物浓度达11.36 μmol/mL时，即能够将半数细胞杀死。当川芎嗪的药物浓度≤ 0.09 μmol/mL时，药物对细胞生长没有明显的抑制作用；当药物浓度达20.32 μmol/mL时，其抑制率达50%。通过这3种抗肿瘤药物的实验研究可知，丹参酮ⅡA与川芎嗪及苦参碱对比，具有显著的抗肿瘤活性。

表1 4种药物对PC12细胞株的抑制作用比较

图3 川芎嗪对细胞形态的影响

图4 细胞生长曲线

3 讨论

目前，恶性肿瘤的治疗方法仍然是以手术、化疗、放疗为主的综合治疗。临床常用的化疗药物主要是通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，但由于大多数化疗药物毒性大，许多患者难以承受[12]。另一方面，某些肿瘤细胞因对化疗药物或放射线不敏感而导致治疗效果不理想。因此，临床急需开发毒性小、治疗效果好的抗肿瘤药物，可以降低患者死亡率及减小化疗药物的毒副作用，并提高其生活质量。近年来，许多中药单体具有非常好的抗肿瘤活性，而且毒副作用较小，其抗肿瘤作用机制除直接杀死肿瘤细胞之外，还与逆转肿瘤细胞多药耐药有关。

本试验应用MTT比色法观察丹参酮ⅡA、苦参碱、川芎嗪对PC12细胞生长的影响，通过丹参酮ⅡA与苦参碱及川芎嗪进行比较，三者的抗肿瘤活性比较差异有统计学意义(P<0.05)，3种抗肿瘤药物的IC50值分别为23.21 nmol/mL、11.36 μmol/mL、20.32 μmol/mL，表明3种药物对PC12细胞都具有抗肿瘤作用，但由于川芎嗪和苦参碱只有在浓度很高时才能发挥明显的抑制作用，所以其毒性较大，安全范围小。丹参酮ⅡA主要用于冠心病、痤疮、痛经、失眠及抗菌消炎等非肿瘤疾病的治疗，近年研究发现，丹参酮ⅡA还具有很强的抗肿瘤活性，可能成为一种很有潜力的抗癌新药。丹参酮ⅡA在浓度很低时，即对肿瘤细胞的生长增殖具有较强的抑制作用，促进细胞凋亡，其浓度与抑制率呈明显的剂量依赖效应，随着浓度的增加其抑制作用增强。研究表明，丹参酮ⅡA的抗肿瘤作用主要表现在以下几个方面：细胞毒作用，对肿瘤细胞的诱导分化作用，诱导细胞凋亡的作用[13-14]。结合进一步的体内试验，包括血脑屏障试验、间质内疗法等，可为丹参酮ⅡA最终用于交感神经系统肿瘤患者提供充分的实验依据。

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