前列腺素E1的工艺优化

陈玉威，张月辉，董慧明

0 引言

前列腺素(PG)在体内由不饱和脂肪酸合成，结构为一个五环和两条侧链构成的20碳化合物。按其结构，前列腺素分为A、B、C、D、E、F、G、H、I等类型，而前列腺素E1是这个大家族的一员。前列腺素E1的化学名称为(11Α,13E,15S)-11,15-二羟基-9-氧代前列腺-13-烯-1-酸，PGE1为白色或淡黄色针状结晶，Mp115～116 ℃，比旋度为-61.6°(c=0.56，THF)。易溶于乙醚(ethyl)。现有技术中的前列腺素E1产品收率低，使用受到限制。为使更多患者能充分利用前列腺素E1所研制的各种品种，我们对前列腺素E1的提取工艺进行研究及优化的选择。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 JJ-2(2003-61)组织捣碎匀浆机；JY98-ⅢDN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；H-1850R台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；pHSJ-2F型实验室pH计(上海精密科学仪器有限公司)；旋转蒸发器RE-2000E(巩义予华仪器有限责任公司)；BP211D型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；日本岛津LC2010高效液相色谱仪；色谱柱：Diamonsil-C18柱(200 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 试剂 氯化钾、枸橼酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、EDTA-2Na、氢氧化钾、氢醌、谷胱甘肽、丙酮、乙醚、石油醚(30～60 ℃)、盐酸、二氯甲烷、无水硫酸钠等，以上试剂均为分析纯。乙腈等试剂为色谱纯。二高-γ-亚麻酸(通河医药有限公司，纯度90%)、 绵羊精囊(黑龙江)。

2 制备方法研究

2.1 制备流程 羊精囊→(KCl,EDTA-Na2,pH8)→酶的混悬液→孵育(氢醌，谷胱甘肽，二高-γ-亚麻酸)→反应液→提取(丙酮，乙醚，二氯甲烷)→前列腺素粗品 →前列腺素E粗品(分离，硅胶柱)。

2.2 样品溶液的制备 酶的制备过程：取冷藏的羊精囊(-30 ℃)200 g，去除结缔组织和脂肪，加入0.154 mol/L氯化钾液200 mL，匀浆后，在10 000 r/min下离心10 min，取上清液，以双层纱布过滤，得清液。残渣再加氯化钾液，捣匀浆，离心过滤后，合并2次上清液。以2 mol/L枸橼酸调pH 5±0.2，于10 000转/min下离心15 min，弃除清液，用磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH=8)洗下沉淀，再加等量的 EDTA-2Na(6.25 μmol/L)溶液搅匀，以氢氧化钾(2 mol/L)调节pH 8±0.1，作为酶的混悬液。全部操作一定要在低温下进行。

孵育过程：取上述混悬液，加入氢醌8 mg和谷胱甘肽100 mg，首先用少量的水溶解氢醌和谷胱甘肽，再加入酶的混悬液中，再加入0.2 g二高-γ-亚麻酸，通氧搅拌，升温至37 ℃，并保温38 ℃孵育1 h，反应终止得反应液95 mL。按二高-γ-亚麻酸纯品质量计，酶促转化率为60%。

提取：将上述反应液加入300 mL丙酮搅拌提取1 h，过滤，滤渣用少量丙酮提取1次，合并滤液，进行旋转蒸发浓缩，除去丙酮。用盐酸(4 mol/L)调节浓缩液至pH 3，以40 mL乙醚分3次振摇提取，弃水层，取醚层，再用30 mL磷酸盐缓冲液 (0.2 mol/L)分3次振摇提取，每次10 mL，弃醚层取水层。用20 mL石油醚(30～60 ℃)分3次(10、5、5 mL)振摇脱脂，弃醚层取水层。再用盐酸(4 mol/L)调pH 3，用20 mL二氯甲烷分3次(10、5、5 mL)振摇提取，加少量无水硫酸钠脱水，密塞置冰箱内过夜，滤除硫酸钠后，在40 ℃以下减压浓缩得黄色油状物，得PGS粗品。

2.3 前列腺素E分离 每1 g PGS粗品需用15 g 100～160目的活化硅胶，混悬于三氯甲烷中，湿法装柱。将PGS溶解于少量三氯甲烷，上柱色谱分离，依次以三氯甲烷、V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=98∶2、V(三氯甲烷)：V(甲醇)=96：4的混合液洗脱，硅胶薄层色谱鉴定追踪，分别收集PGA和PGE部分。在35 ℃以下减压浓缩，除尽三氯甲烷、甲醇，得PGE粗品。

2.4 前列腺素E提取工艺 采用均匀设计法，选择影响酶转化的4个主要因素：孵育温度(A)、pH值(B)、提取时间(C)、通氧纯度(D)为考察指标，见表1。

表1 试验因素水平表

3 薄层层析法初步定性分析

前列腺素E的初步定性分析可以使用薄层层析的方法。硅胶G板自然风干后,活化2 h，样品溶液用 20 μL的毛细管点板，并利用标准品作对照，在展开槽内直立上行展开，平行试验6组。待展开自然风干后，喷5%磷钼酸乙醇溶液显色剂显色，放烘箱中烘数分钟观察斑点特点，计算比移值Rf。

4 前列腺素E1的含量测定

4.1 色谱条件 检测波长：214 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：乙腈：0.02 mol/L磷酸二氢钾(pH=4.9±0.5)=30∶70；色谱柱：迪马C18(200 mm×4.6 mm,5 μm)；进样量：10 μL；理论塔板数：以前列腺素E1峰计算应不低于2 000。

4.2 对照品溶液制备 精密称取PGE1对照品0.5 mg，精密加入25%乙醇溶液5 mL，制成0.1 mg/mLPGE1溶液。精密吸取0.5 mL至5 mL容量瓶中，加25%乙醇溶液定溶至刻度，过0.22 μm 微孔滤膜,即得。

4.3 供试品溶液制备 精密称取自制PGE粗品0.1 mg，精密加入无水乙醇溶液1 mL，过0.22 μm 微孔滤膜,即得。

4.4 含量测定方法 精密量取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪中，按“4.4.1”项下条件操作，测定前列腺素E1吸收峰的峰面积积分值，计算前列腺素E1含量。 C样=A样×C对/A对

5 试验结果

5.1 展开剂的优选 实验选择不同种类及配比的溶剂体系作为展开剂，同时对样品和标准品进行展开，前列腺素E初步分析结果如表2所示。

通过表中可以看出，5号V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(乙酸) =90∶5∶5是比较合适的展开剂，PGE1Rf值适中，单向一次薄层层析即能分离出4个以上颜色较深、集中而清晰可见的斑点，分离效果较理想。如图1。

表2 硅胶G板不同展开剂的薄层层析结果

图1 前列腺素E1初步分析薄层图

表3硅胶G板Rf值平行试验结果

第1组第2组第3组第4组第5组第6组平均值Rf0.470.450.470.460.450.450.45

5.2 正交试验结果 不同孵育温度、pH值、提取时间、通氧纯度的正交试验结果见表4。

直观分析：从表4可以直观看出，孵育温度、pH值、提取时间、通氧纯度对PGE1含量得率都有影响。PGE1提取条件的最优组合为：A3B3C2D2，即孵育温度37 ℃、pH值8、提取时间1 h、通氧纯度为纯氧。

表4 L9(34)正交试验设计及结果分析表

方差分析：结果见表5和表6。表5 方差分析的结果表明，孵育温度有极显著性影响(P<0.05)。

表5 前列腺素粗品方差分析表

以前列腺素粗品为考察指标，表中极差R值大小显示，各因素主次为A>B>D>C；方差分析结果表明，A因素的影响具有极显著意义(P<0.01)，B因素具有显著意义(P>0.05)，D因素接近显著值，C因素的影响无显著意义，表明本实验设计较有意义。结合R水平，得出最佳提取工艺为A3B3C1D1最为合适。

表6 PGE1含量方差分析表

以PGE1含量为考察指标，表中极差R值大小显示，各因素主次为A>D>B>C；方差分析结果表明，A因素的影响具有极显著意义(P<0.01)，D因素的影响具有显著意义(P<0.05)，B因素接近显著值，C因素无显著意义(P>0.05)，表明本实验设计较有意义。结合R水平，得出最佳提取工艺为A3B3C1D1最为合适。

综合以上分析，C因素在两种考察指标中均无显著影响。参考实际工作需要，故确定A3B3C1D1为最终选择提取条件，即孵育温度37 ℃、pH值8、提取时间1 h、通氧纯度为纯氧。

5.3 验证试验 称取绵羊精囊5份，每份1 kg，以上述前列腺素E1最佳提取工艺进行提取。测得PGS粗品及PGE1含量，结果见表7。

表7 前列腺素粗品三批试验结果

前列腺素粗品平均值4.13 g，RSD=4.45%；前列腺素E1含量平均值为49.21%，RSD=4.22%，验证结果说明符合正交试验设计，该工艺稳定可行。

6 讨论

6.1 合成酶的选择及处理 前列腺素合成酶在动物组织中以绵羊精囊的含量最高，底物转化率达75%，兔肾髓质含41%，羊睾丸含18%。绵羊精囊易择取，好收集，速冷保存于-30 ℃～-20 ℃，放置半年不失其活力。由于前列腺素酶存在于细胞内质网膜微粒体中，需将精囊匀浆经离心后，得酶的制剂。

6.2 温度与pH选择 最适合温度37 ℃，绵阳精囊合成酶系最适pH 8。pH缓冲液以乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)为最佳，一般在10 min已趋于完成反应。

6.3 孵育条件的影响 孵育条件对PG的产生影响很大，孵育液中加入谷胱甘肽能显著地增加PGE1的产率，同时对PGF的形成起抑制作用。其他含硫基化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、苯硫酚、硫基乙酸和血清白蛋白等都比谷胱甘肽差。

6.4 硝酸银硅胶薄层色谱 应用硝酸银硅胶板可分离出多种已知的前列腺素，普通硅胶板只能检出PGA、PGE、PGF，不能检出仅差一个双键的PGE1和PGE2。硝酸银硅胶板的制备：取10 g硅胶G(220目)与1 g硝酸银，溶于60 mL蒸馏水的水溶液中混合，调成浆状，铺在已除油渍的玻璃板上，待固化后，置105 ℃活化0.5 h后，收藏于棕色干燥器中备用。

6.5 获得天然PG的方法有生物合成法、化学合成法和半合成法 采用花生四烯酸为前体，从羊精囊提取前列腺素合成酶，并加入谷胱甘肽、氢醌等辅助刺激剂，在充分给氧的条件下，使花生四烯酸转化成PG，最后分离、提纯即得PGE1。其工艺特点是原料丰富、操作简便、成本较低。

6.6 有关PGE1提取工艺的研究报道较多，本试验不仅在提取方面做了优化，主要在分离及精致过程中做了重点考察，通过对PGS粗品的上柱分离，并对其进行硅胶薄层色谱鉴定追踪，得到PGE粗品。在精致的过程中，同样通过硝酸银硅胶G薄层鉴定追踪，PGE1的峰区集中于Rf值为0.44～0.46得到PGE1结晶，熔点115～116 ℃。

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