β-环糊精研究及应用进展

赵永亮，管景帅，温金娥，王卫国，贾 柯，穆甲骏，王 卫

（1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001；2.河南经济贸易高级技工学校，河南 新乡 452700）

0 引言

环糊精（Cyclodextrin，CD）是直链淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin Glycosytransferase，CGTase，EC2.4.1.19）作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12 个D-吡喃葡萄糖单元.工业上应用的主要3 种环糊精类型为α-CD（含6 个CDs）、β-CD（含7 个CDs）和γ-CD（含8个CDs）[1].环糊精是略呈锥形的圆筒状分子，一端大、一端小，使整个环糊精分子呈内疏水、外亲水的结构[2].环糊精这种特殊的分子结构，使其疏水空洞内可以包络一些客体分子，形成稳定的包合物[3-4]，从而改变客体分子的溶解度、挥发性和化学性能等理化性质[5].环糊精的结构不同，性质差异也很大，由于β-CD 的分子空腔大小适中（内径70～80 nm）、结晶性能良好（易于提纯）、生产成本低，是目前应用范围广且生产最多的环糊精产品[6].

β-环糊精（β-Cyclodextrin，β-CD）是一种无臭无毒的白色结晶粉末，它是由7 个葡萄糖分子组成的环状结构化合物，整个分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构.在筒状结构中，空腔内由于C3和C5上的氢原子对C1上的氧原子的屏蔽作用，使其形成了有C1、C4、C5组成的疏水区.分子空腔外部表面的上端和下端都由羟基（C6伯羟基及C2和C3仲羟基）构成，形成亲水区，使分子外部具有亲水性.这种结构非常稳定，不易受酶、pH、热等外在条件的影响，利用这个特殊的筒状结构，β-CD可与许多无机、有机分子结合成主客体包络物[7-8]，并能改变客体分子的理化性质，具有保护、稳定、增溶客体分子和选择性定向分子的特性，β-CD 作为改良剂、稳定剂、吸附剂、赋形剂等，在食品[9]、环保[10]、医药[11]等领域都有广泛的应用.

1 环糊精的生产及常用菌种

工业中的环糊精大多数是通过生物酶法生产的.化学合成的方法虽然也可以得到环糊精[12-13]，但与生物酶法相比，产率低、产物不容易分离提纯，只适合在实验室中做科学研究.概括起来，工业上环糊精的生产主要分为4 个阶段[14]：菌种的选育或构建，培养，制备CGTase（分离纯化和浓缩干燥[15]），淀粉的CGTase 转化，环糊精的分离、纯化与结晶.

优良菌种是环糊精生产的关键，优良的产β-CD 菌种不仅应该产酶量高，而且环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）还要具有很强的选择降解淀粉的能力，且主要生成或只生成一种CD.现有的资料表明，自然界中产CGTase 的微生物种类众多，有芽孢杆菌、放线菌、微球菌、短杆菌、曲霉、古细菌等.工业化生产中使用的产CGTase 菌种多来自芽孢杆菌属，主要有嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）、嗜 碱 芽 孢 杆 菌（B.alcalophilus）、浸麻芽孢杆菌（B.macerans）、凝结芽孢杆菌（B.coagulans）等少数几种.这些菌种分泌的胞外酶[16-17]作用于不同来源的淀粉时，环糊精的收率有所不同，大多数情况下是α、β、γ 3 种环糊精的混合物.不同来源的酶，生成3 种糊精的先后及比例有所不同，可将CGTase 分为α-CGTase、β-CGTase、γ-CGTase 3 种类型.

2 β-CGTase 研究概况

β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-Cyclodextrin Glycosyltransferase，β-CGTase，EC2.4.1.19）属 于α淀粉酶家族[18]，是一种由5 个结构域组成的多功能型酶，作用于淀粉后使葡萄糖基发生转移从而发生环化反应生成β-CD[19].β-CGTase 是工业上大量生产β-CD 的专一性酶，但是我国的β-CD 菌种产酶量不高和生产成本过高使产业化受到限制，因此构建具有更高β-CD 特异性的突变体菌株是提高CGTase 活力的关键.

根据现有的资料报道，获得β-CGTase 的途径主要有3 种：从自然界中筛选野生菌株，根据基因文库进行克隆表达和对已知目的基因片段进行蛋白质工程改良.其中野生菌株筛选不仅最为直接有效，而且也是后两种方式的基础.

2.1 诱变育种

从自然界中筛选的野生菌株，很难适应工业化生产的要求.而理想的工业化菌种必须具备稳定的遗传性状、无污染、生长迅速、短时间内能生产大量的目标产物等特性.要想得到高产量和传代稳定的菌株，一般都会采用诱变育种的方法.微生物的诱变育种，是用人工手段（理化诱变剂）诱发微生物的基因发生突变，染色体结构发生变异，通过筛选，将少量正突变菌株中的优良菌株挑选出来，然后使其在最优的发酵条件下生长并合成出大量的目的产物.目前诱变育种方法主要包括物理诱变、化学诱变、生物诱变和复合诱变.根据报道，王雁萍等[20-21]利用离子注入的方法对产β-CGTase 菌株02571 和Bacillus spHA-1 进行选育发酵条件研究，结果发现其产酶能力提高，酶活分别达到6 000 U/mL 和6 800 U/mL.何飞燕等[22]对菌株gxmf1 通过UV 和氯化锂复合诱变处理，得到一株产β-CGTase 较高的菌株B15，试验结果表明，产酶量提高了255%，并且具有良好的传代稳定性.

2.2 CGTase 的定向改变

从野生菌株或者诱变育种中得到的CGTase 往往都具备一定的工业缺陷，如突变无定向性、酶活低、专一性和稳定性差等.为了解决这些问题，可以通过现有的技术手段对菌株进行改造，使其符合最佳的工业化生产要求.

2.2.1 物理化学手段

在CGTase 研究初期，DNA 重组技术还未诞生，为了分析CGTase 的性质，通常利用一系列可以与特定氨基酸残基发生反应的化学试剂对酶进行修饰，再通过产物的变化进行表征.利用这种方法能粗略地分析出CGTase 中有催化功能的氨基酸残基，这样经修饰后的CGTase 活性及性质都有不同程度的变化，如Alcalde 等[23-24]对Thermoanaerobacter sp.501 菌株进行了45%氨基酸琥珀酰化和Lys 侧链乙酰化修饰，分别表现为转糖基作用增强和水解活性增强.

2.2.2 分子生物学手段

自人类首次成功获得Bacillus macerans 中的CGTase 基因片段至今，约38 种不同来源的CGTase基因片段相继得到证实.随着分子生物学的迅猛发展，人们开始从酶的化学修饰转向了更为精确的分子水平（基因的定向改造）.通过基因工程技术手段对β-CGTase 进行体外定点改造来获取高专一性、强适应性的β-CGTase.

通过对CGTase 与底物结合的机制分析，改变酶蛋白中底物结合位点处的氨基酸，可提高酶的催化活性.先锁定与亚位点处结合的关键氨基酸残基，再运用基因改造的手段替换关键位点的氨基酸残基，分析产物特异性的变化.由于活性催化区域的氨基酸残基数目较大，因此所选突变氨基酸残基的对象相对集中在位于保守性较差的亚位点处[25]，如Bacillus circulans（strain 251）中的亚位点-3，-7[26].迄今为止，已经完成10 种不同来源CGTase 的定向改造工作，如 Shim 等[27]对Alkalophilic Bacillus sp.I-5 菌株89 或100 位点 进行改造，使原残基Y 突变为F 残基，结果β-CD 产量增加.Li 等[28]对P.macerans JFB05-01 菌株47位点进行改造，使原残基K 突变为R，H，T，S，L 残基，结果α-CD 产量下降，β-CD 产量增加.

3 β-CD 的应用

3.1 β-CD 在医药行业的应用

β-CD 空腔大小适中，包合能力强，作为一种新型的药物包合材料，与小分子药物制成β-CD 包合物后，能显著改善药物的理化性质并且安全无毒，所以β-CD 经常用作药品的赋形剂.

3.1.1 增加药物的稳定性

有不少药物的活性成分易受热、光、空气和化学环境的影响[29]而失去药效，如将这些挥发性成分采用β-CD 包封，可防止其逸散，即使温度、pH 等外部条件发生改变，仍能保持药物的稳定性，从而提高药物的疗效.孟庆刚等[30]试验表明，咳喘宁胶囊中挥发油β-CD 包合物的稳定性明显高于物理混合物，β-CD 可有效防止挥发油的挥发，提高其稳定性.

3.1.2 提高药物的溶解度及生物利用度

难溶性的药物与β-CD 包合后，由于β-CD 的亲水性可以提高药物在水中的溶解度，特别是增加一些脂溶性化合物在水中的溶解性，从而提高药物的吸收效果.如果包合常数大小合适，β-CD也可提高包合物制剂的生物利用度[31]、增强药效和减少不良反应.Wei 等[32]的试验表明，鱼腥草素经β-CD 包合后，溶解度增大了11.4 倍，溶出速度大大加快，并且有效掩盖了鱼腥味，从而提高了药物的生物利用度.

3.1.3 控制药物的释放速度

β-CD 与药物以物理形式或者共价键的方式结合，包合后可以改变药物的释放行为，也就是能控制药物的释放，还可以提高亲脂性药物在毫微囊中的载药量[29]，从而达到缓控释给药的目的，并提高药效.Ungaro F 等[33]考察了β-CD 与药物nicardipine（NIC）的释放行为.试验表明:药物释放速度随β-CD 与药物物质的量的比的增大而减慢，β-CD 的存在减小了NIC 的有效扩散，从而延长了药物的作用时间.

3.1.4 掩盖苦味和异臭

有些药物（特别是中草药）味道苦涩，刺激性气味强烈，患者难以服用，如果用β-CD 进行包合，可避免药物与味蕾直接接触，减少苦味，也能掩盖药物的不良气味.侯曙光等[34]在酸性和碱性环境中，用β-CD 将盐酸雷尼替丁制成了包合物，有效掩盖了药物的不良气味.

3.2 β-CD 在食品行业的应用

β-CD 可以作为食品和食品成分的稳定剂（防挥发、抗氧化），用来保护芳香物质和保持色素稳定[35]，还可除去异味和苦味（如海产品，乳制品）.食品中的活性成分（如维生素）与β-CD 形成包络物，可以钝化光敏性和热敏性.Chen 等[36]用β-环糊精制备虾青素的包合物，虾青素自身的水溶性小于0.15 mg/mL，而制备的包合物不但提高了虾青素的水溶性，而且大大提高了虾青素对温度和光照的稳定性.

3.3 β-CD 在环保行业的应用

3.3.1 农药污染物治理、农药残留检测

随着科技的进步，农药在农业上得到了广泛应用，但多数农药具有疏水性，易被土壤胶体吸附，导致其在土壤中传输、降解困难，从而造成农药的积累和残留[37].Kamiya M 等[38]研究发现，β-CD在含有腐殖酸的水溶液中可促进光诱导自由基的生成，并对其具有包结作用，从而引发农药光降解反应.

3.3.2 污水处理和土壤改性

近年来，由于环境污染和工业废水排放，使土壤中沉积了大量浓度高且成分复杂的有害重金属离子，严重降低了土壤质量.随着工业的发展，重金属离子对水体的污染也日益严重，这些污染已经影响到工农业生产，如果不及时处理，最终将会危害人类健康.β-CD 在一定条件下可以直接和重金属离子配位生成多核金属化合物，开辟了解决此问题的一种全新的途径.Ehsan 等[39]研究表明，β-CD 与乙二胺四乙酸二钠联合作用可以去除土壤中镉、铬、铜、锰等多种重金属离子.

3.4 β-CD 在分析化学上的应用

在分析化学方面，由于β-CD 是有手性中心的手性分子，对有机分子有识别和选择的能力，可应用于柱色谱分离[40]或者电泳分离[41]；β-CD 的空腔易与客体分子形成包合物从而影响客体分子的光谱性质，因此可应用于分析检测[42]和痕量金属含量的测定[43]等方面.

4 β-CD 的改性及其衍生物的研究概况

由于β-CD 在水中的溶解度较小[44]和包合能力有限，使其在工业应用上有一定的局限性.因此，人们开始对β-CD 母体进行改性，以改变β-CD的理化性质，推出新型功能材料并提高其应用效果.

β-CD 改性就是指在β-CD 母体结构骨架不变的基础上引入一些官能团，进行修饰，使其成为具有不同性质或功能的产物，从而优化β-CD 分子的性能.改性后的β-CD 也叫β-CD 衍生物.目前，β-CD 改性主要有化学法和酶工程法，其中化学法改性主要是对β-CD 空腔外表面上的羟基通过酯化、醚化、去氧化等加以修饰，目前化学改性效果优良的方法主要是烷基化改性和羟烷基化改性，而酶工程法一般是通过特定的酶（CGTase 或普鲁兰酶）将单糖或者寡糖结合到β-CD 上.现有的资料表明，β-CD 衍生物比天然β-CD 具有更优良的特性，改性后的环糊精的增溶性、稳定性、生物酶性、识别选择性、光电化学性能等均大大提高.如曹新志等[45]采用相溶解度法测定了黄酮在不同浓度甲基-β-CD 与β-CD 的增溶效应，甲基-β-CD衍生物的增溶作用明显强于母体β-CD.而且甲基-β-CD 包合黄酮的能力也比母体β-CD 强.有些CD 衍生物主要应用于仿生学分子识别、模拟酶与生物膜功能的研究，这方面的研究有巨大的诱人前景.如宋发军等[46]利用双[6-氧-（丁烯二酸-1，4-单酯-4）]β-CD·Fe3+·H2O2同时模拟葡萄糖氧化酶（GOD）和过氧化物酶（POD）来催化测定葡萄糖含量.

5 结论与展望

β-CD 是客体分子的理想载体分子，是一种新型的包合材料.由于β-CD 经修饰后具有更好的包合效果和包合率，所以β-CD 衍生物无可争议地成为新一代的高级载体材料，尤其是2-羟丙基-β-CD 已显示出了巨大的应用价值，这也是近几年β-CD 研究的趋势和热点.由于β-CD 独特的优良性质使其在工业应用上有着激动人心的想象空间，然而，由于受目前研究技术所限，其在有些领域还不能广泛应用.对β-CD 研究停滞不前的主要原因归根结底是对CGTase 产物专一性机理的认识不足，这也是目前首要解决的难题和面临的挑战.解决这一问题需要对CGTase 的空间结构及氨基酸功能有更为深刻、全面的认识和分析，还要进一步阐述CGTase 的详细催化机理.这一技术瓶颈一旦突破，我们就可以采用遗传工程的方法，得到高产、专一性强的产CGTase 的菌株，以适应大规模的工业生产.因此，通过新的研究方法来对CGTase 进行定向改造是未来研究的重点.

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