沙门氏菌毒力因子的研究进展

曹恬雪，蒋文灿,2*，何文成，纪凤仙，魏志刚

(1.四川农业大学动物医学院，四川 雅安 625014；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安 625014)

沙门氏菌(Salmonella)感染可以引起人和动物的伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症等疾病，还可以造成怀孕母畜发生流产。不但导致畜禽死亡，还会因生长迟缓、产量下降等造成重大的经济损失。沙门氏菌也是人类食物中毒的主要病原之一，具有重要的公共卫生学意义。

研究表明沙门氏菌的致病性是由大量的毒力因子相互作用所致。本文对国内外在沙门氏菌的结构性毒力因子、肠毒素、毒力质粒、毒力岛及Ⅲ型分泌系统等方面的研究进展进行综述，以期为开展相关研究提供参考。

1 结构性毒力因子

1.1 菌毛菌毛是细菌表面的纤细结构，与细菌黏附上皮细胞及在小肠粘膜的定植有关。根据菌毛形态和凝集红细胞的能力，沙门氏菌菌毛主要分为4类。Ⅰ型和Ⅱ型菌毛形态相似，Ⅰ型菌毛广泛分布于沙门氏菌属内，Ⅱ型菌毛仅在鸡白痢、都柏林、乙型副伤寒等沙门氏菌中被发现。Ⅰ型菌毛可以介导甘露糖敏感血凝反应，而Ⅱ型菌毛缺乏凝集红细胞的能力。Ⅲ型和Ⅳ型菌毛形态相似，较细而且容易弯曲，在甘露糖存在时仍可凝集鞣酸处理的红细胞。Ⅲ型菌毛只在肠炎、鼠伤寒等沙门氏菌中表达，Ⅳ型菌毛的报道较少。沙门氏菌还有两种体积差异较大而且缺乏凝集红细胞能力的菌毛，按其主要亚单位蛋白大小命名为 SEF14 和 SEF17[1]。

菌毛有助于菌体黏附到动物细胞并促进其定植，同时带菌毛菌株的致病力和活力均强于先天无菌毛菌株或菌毛缺失的菌株。沙门氏菌菌毛作为抗原被广泛应用于免疫和病原的检测方面。研究表明肠炎沙门氏菌Ⅰ型和Ⅲ型菌毛抗原免疫小鼠存活率提高60%，从而预测肠炎沙门氏菌SEF14、SEF17和SEF21等多种菌毛的联合免疫可以产生更好的保护效果[2]。根据SEF14柔毛抗原的特性，Rajashekara等建立了一种简便的乳胶凝集试验成功区别检测肠炎沙门氏菌的感染[3]。近年，国内研究者利用鼠伤寒沙门氏菌SEF14菌毛基因agfA作为禽流感疫苗载体，构建能够引起机体细胞免疫的活体重组疫苗，对禽流感的预防具有重要意义[4]。

1.2 外膜蛋白外膜蛋白(Outer membrane protein)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分。按其在细胞中的拷贝数高低，沙门氏菌的外膜蛋白可分为外膜A蛋白(OmpA)、微孔蛋白、脂蛋白和微量蛋白。OmpA属于跨膜蛋白，对外膜结构的维持起着重要作用。缺乏OmpA的突变株细菌的外膜蛋白不稳定，不能转运肽类，氨基酸总转运率下降，并且失去F因子介导的细胞接合功能。当OmpA溶于高于50℃的SDS溶液中，其分子量增加，因此OmpA又称热修饰蛋白。微孔蛋白也称为基质蛋白，是一类具有渗透特性的主要外膜蛋白。它以非共价键与肽聚糖紧密结合而形成相对非特异性的通道，因此具有通透特性。脂蛋白则为细胞外膜中含量最丰富的结构蛋白，但并不是细菌生长所必需的，有利于维持外膜结构的稳定性。微量蛋白在细胞内含量低，却具有相当重要的功能；许多微量蛋白(如TonA、FepA等)与细胞生长密不可分。

伤寒沙门菌的OmpD参与巨噬细胞和肠上皮细胞对细菌的识别；微孔蛋白能触发多重协同信号转导途径，诱发细胞激活及细胞因子释放，增强蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶A及蛋白激酶C等[5-6]。伤寒菌的ompS1、ompS2基因编码与OmpC、OmpF蛋白相关的两个低水平表达的外膜蛋白，利用该基因的突变菌株感染小鼠，其毒力比野生株明显降低[7]。伤寒菌外膜蛋白及铁调节外膜蛋白能刺激宿主产生细胞和体液免疫反应[8]，具有良好的免疫保护性，因而可用于高效价抗体和疫苗的研制。利用反应性关节炎患者的血清及关节液进行ELISA检测，表明伤寒菌的外膜蛋白是触发反应性关节炎的细菌组分[9]。研究表明鼠伤寒沙门氏菌的OmpA能够刺激树突细胞产生抗肿瘤免疫，为抗肿瘤的免疫治疗提供了新途径[10]。

1.3 脂多糖脂多糖(Lipopolysaccharides)位于革兰氏阴性菌外膜的最表面，在细菌崩裂时释出，是很强的发热原。沙门氏菌的脂多糖主要由类脂A、核心多糖和侧链多糖组成，在防止宿主吞噬细胞的吞噬和杀伤作用中起重要作用。类脂A是构成内毒素的主要部分，吞噬细胞相应受体识别类脂A的特定结构而引起相应的炎症反应。在对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖的研究中显示，脱酰酶LpxR过量表达时引起类脂A的3'-O-脱酰作用脱掉两条酰基链，类脂A的结构发生改变，而不能被吞噬细胞相应受体识别，从而有利于细菌在吞噬细胞中增殖；另一种脱酰酶PagL隐藏于细菌外膜上，某些点突变可使PagL从隐藏区域释放出来，沉淀分析显示隐藏的PagL与脂多糖相关，而释放出的PagL突变体却与膜蛋白相关，这种突变会影响PagL与脂多糖之间的相互作用[11]。

侧链多糖在LPS的最外侧，即O抗原。Kumirska等利用核磁共振波谱法及质谱分析法，首次从沙门氏菌血清群O∶28的101种血清型中确定一种特殊的O抗原单位结构，这在沙门氏菌血清分型中具有重大意义[12]。抗脂多糖单克隆抗体对鸡白痢沙门氏菌和其他血清群沙门氏菌都具有特异性，可以用于沙门氏菌检测方法研究[13]。用缺失LPS和恢复LPS的沙门氏菌SstpNPG分别感染小牛，在所有小牛的血液及脑组织中都能检测到SstpNPG，但只有LPS恢复株引起实验小牛的神经症状。该研究首次证明牛的非伤寒沙门氏菌脑病的临床症状与脂多糖有关[14]。

1.4 荚膜早期对伤寒沙门菌的研究表明有荚膜菌株比荚膜缺失菌株引起发病率高，荚膜是沙门氏菌重要的毒力因子。荚膜也具有一定的抗原性又称为Vi抗原。荚膜能够阻断O抗原与其相应抗体的反应，对细菌本身具有保护作用。伤寒沙门菌的荚膜对其存活于宿主体内及逃避机体的防御机理具有重要作用。近年，荚膜多糖免疫法开始用于预防伤寒沙门氏菌病。荚膜多糖的产生依赖于细菌的生长，通过补料分批培养优化伤寒沙门氏菌生长过程中产生的荚膜多糖，结果表明荚膜多糖的合成与营养成分及发酵条件密切相关，在细菌生长初期和稳定期，高浓度的葡萄糖会抑制荚膜多糖的合成[15]。根据Vi分子带负电荷、Vi在不同溶剂中的选择性溶解度以及横向气流微滤等条件最大化地除去杂质，使得最终获得高纯度的荚膜多糖，该方法可用于规模化生产，其产量高且成本低，为制备荚膜多糖疫苗提供了有效途径[16]。

荚膜多糖的保护性取决于O-乙酰基团的存在，利用Vi抗血清作为酶免疫分析法(EIA)的阳性抗体，进行伤寒沙门菌荚膜多糖的O-乙酰基团的检测，并用核磁共振法对比其灵敏度，表明EIA能够鉴别O-乙酰化与非O-乙酰化的荚膜多糖样品，但对于O-乙酰化水平低于25%的样品，该方法灵敏度低；Vi抗血清可用来检测荚膜多糖亚单位疫苗中菌荚膜多糖的O-乙酰化水平，以评价其免疫原性，有利于对荚膜多糖疫苗的质量控制[17]。将伤寒沙门氏菌荚膜多糖与白喉类毒素结合后接种小鼠并检测其抗体水平，结果表明荚膜多糖结合白喉类毒素的量越多其免疫保护性就越强，利用该结合物(Vi-DT)免疫接种能够克服单独使用荚膜多糖引发的免疫抑制，从而建立了Vi-DT的理化特性与免疫应答反应之间的相关性[18]。

2 肠毒素

外毒素是病原菌在生长繁殖过程中产生的对宿主细胞有毒性的可溶性蛋白质。外毒素有极强的毒性作用，也具有良好的免疫原性。在0.4%甲醛溶液作用下外毒素可脱毒为类毒素，但仍保留其原有的抗原性，可作为疫苗进行免疫接种。沙门氏菌肠毒素与宿主腹泻等症状有关，有研究显示其作用机制与霍乱毒素、大肠杆菌肠毒素相似。早期研究中在鼠伤寒沙门菌中发现一种热敏的、细胞结合型的霍乱毒素(CT)样肠毒素，可引起CHO细胞伸长；在兔结扎肠中诱导液体分泌，与GM1神经节苷脂结合，可提高兔肠细胞内cAMP和前列腺素E2水平；其生物学活性可被抗CT抗体所中和。利用γ射线处理沙门氏菌肠毒素，获得的类毒素没有毒性但保持原有的免疫原性，从而制备类毒素疫苗，口服和腹腔注射实验小鸟保护率平均达到95%以上。表明γ射线脱毒方法具有安全便捷的特点，同时可避免动物机体对传统甲醛疫苗产生的应激反应[19]。

研究表明肠毒素(stn)基因是鼠伤寒沙门菌感染机制中重要的毒力因子之一，其编码产物能诱发小鼠肠腔液体分泌反应[20]。此外，Akinyemi等为检测水源中沙门氏菌的多重耐药性和肠毒素基因的情况，从当地随机采集200个样品分离沙门氏菌并进行药敏试验和stn基因检测，结果37个样含有沙门氏菌，这些菌分属于7个血清型；其中60%含有stn基因，而且携带有stn基因的菌群表现出对多种抗生素的抵抗力。因此，肠毒素基因对细菌的耐药性有一定水平的提高[21]。

3 毒力相关基因

沙门氏菌毒力基因存在其染色体和质粒中。在沙门菌染色体中编码毒力相关基因的特定区域被称为毒力岛(SPI)，含有许多与毒力有关的基因，还编码与细菌侵袭力直接相关的Ⅲ型分泌系统(T3SS)。除染色体中毒力岛编码的毒力基因外，还有小部分毒力基因位于质粒中。

3.1 毒力岛及Ⅲ型分泌系统

3.1.1 毒力岛 沙门氏菌的SPI1、SPI2、SPI3、SPI4和SPI5已研究比较清楚。SPI1位于沙门菌染色体上、下游分别为fhlA和mutS的63'位点处，至少含29个基因与Ⅲ型分泌系统各组分的编码相关；SPI1编码的蛋白可以侵入宿主细胞并诱导巨噬细胞凋亡，在沙门氏菌侵袭巨噬细胞和肠上皮细胞过程中发挥重要作用。SPI2含40个基因，组成4个操纵子，ssa编码Ⅲ型分泌系统成分，ssr编码分泌系统调节子，ssc编码分子伴侣，sse编码分泌系统效应蛋白；SPI2控制沙门氏菌在吞噬细胞和上皮细胞内的复制，并使沙门氏菌逃避巨噬细胞辅酶依赖的杀伤作用。SPI3含 10个 ORFs，组成 6个转录单位，其中mgtCB的产物可介导细菌在巨噬细胞和低Mg2+环境中存活。研究表明携带SPI1+SPI2与沙门氏菌的致病性呈正相关，而且SPI3可作为检测沙门氏菌的毒力标志[22]。SPI4含18个ORFs，编码介导毒素分泌的Ⅰ型分泌系统，并参与调节细菌对巨噬细胞内环境的适应[23]。SPI5位于都柏林沙门氏菌染色体25'处，上、下游分别为serT和copS/copR，含sop、sip、pip等基因，编码产物与肠黏膜液体分泌和炎症反应相关，并且由SPI1和SPI2编码的蛋白所调控[24]。

近期陆续报道了在伤寒、鼠伤寒、丙型副伤寒等沙门氏菌中新鉴定出SPI6、SPI7、SPI8、SPI9、SPI10、SPI11、SPI12等。SPI6通过引导伴侣蛋白调节菌毛操纵子；SPI7在丙型副伤寒沙门氏菌中被鉴定出，具有血清特异性，编码sopE噬菌体、Vi抗原基因和ⅣB操纵子[25]；SPI8与pheVtRNA基因相连，编码2种细菌素的伪基因及整合酶基因；SPI9编码Ⅰ型分泌系统和独立的Rtx2样蛋白，与SPI4相似；SPI10包含sefB、sefC和sefR基因，编码sefA-R和噬菌体以及引导伴侣蛋白调控菌毛操纵子[26]。

3.1.2 Ⅲ型分泌系统 沙门氏菌的T3SS分别由SPI1和SPI2的基因编码产物组成，包括外膜蛋白、内膜蛋白、附属蛋白及一些特异性靶蛋白。T3SS有两大功能：一是指导细菌蛋白转运至宿主细胞，并激活相关的信号通道，使宿主细胞产生细胞因子，以诱导巨噬细胞凋亡；二是促使与宿主细胞接触的侵袭小体在细菌表面的装配。T3SS可分泌几种效应蛋白刺激宿主细胞的信号转导途径，引起一系列细胞反应[27]。该分泌和转移过程是由非常复杂的转录机制和转录后机制调控的。转录机制的调控主要受时间和空间的限制，转录后调控机制在与宿主细胞相互接触后发挥其功能，侵入基因表达的调控由转录水平的环境因素决定。目前，在分子水平仅发现DNA的超螺旋结构会影响蛋白的分泌；在蛋白水平，AraC家族的InvF和OmpR/ToxR家族的HilA参与沙门氏菌的侵入，HilA又调节OrgA、SipC和InvF，它们形成一个调控茎环结构[28]。此外，T3SS还受到调控网的影响，如菌毛调控系统、PhoP/PhoQ调控系统[29]和反应调节蛋白等。

3.2 毒力质粒 早期研究表明，在能引起严重全身性感染的沙门菌中普遍存在一大小约50 kb～90 kb的质粒，与沙门菌的毒力密不可分，将其称为沙门氏菌毒力质粒(Salmonellaplasmid virulence，spv)。毒力质粒含有一段高度保守的约8 kb的核酸片段，即spv基因。该基因由6个ORFs构成：正性调控基因spvR、4个效应基因spvA、spvB、spvC、spvD以及位于这5个基因之后的orfE。目前已知spvR编码LysR/MetR家族转录活化因子的细菌调节性蛋白，并且使基因按照合成SpvABCD的方向进行转录[25]。刘华伟等针对spvR基因设计PCR引物，用于检测细菌样品，可快速特异性检测出具毒力质粒的沙门氏菌[30]。spvB编码一个65 ku的单链多肽，spvA、spvC、spvD分别编码大小为28.2 ku、28 ku及24.8 ku的蛋白。研究表明，spv基因有利于沙门氏菌在肠外组织细胞内的生长，其产物与细菌的粘附、定植及血清抗性等毒力表型密切相关。研究还表明，spv基因是细菌在巨噬细胞内存活和生长繁殖所必需的，毒力表现为细胞毒性，细菌增殖可致巨噬细胞凋亡[31]。

4 小 结

沙门氏菌的菌毛、外膜蛋白、脂多糖、荚膜等均属于重要的菌体结构成分，目前，沙门氏菌结构性毒力因子的生物学特性及致病机制方面已研究的比较透彻，并且在临床应用方面不断获得新的研究成果。多数毒力因子都具有良好的免疫原性，比如将白喉类毒素结合到荚膜多糖上增强其抗原性，为疫苗的研制打开了新思路。近年来，毒力相关的基因逐步成为研究重点，包括编码结构性毒力因子的基因、肠毒素基因和某些调节基因。这些基因主要存在于沙门氏菌的染色体和质粒中，因此毒力质粒和毒力岛等方面的研究不断深入，成为沙门氏菌研究的热点之一。目前，关于沙门氏菌已知的5个毒力岛研究较为清楚，近期也有新的毒力岛被鉴定出来，是否还有其他潜在的毒力岛还有待进一步研究。利用基因敲除等方法除去沙门氏菌的毒力部分，获得的减毒沙门氏菌可作为载体或佐剂，其应用也十分广泛，不断开发出新的生物制品，对预防沙门氏菌病及其他传染病具有重要意义。减毒沙门氏菌将是现在到将来很长一段时间内的重点研究对象之一。

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