血清以及基因分型技术在副猪嗜血杆菌流行病学和毒力鉴定中的研究进展

杨 洋，于 爽，徐晓阳，曹雪峰，罗永久，任志华，钟志军，彭广能

(四川农业大学动物医学院 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安 625014)

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)为猪上呼吸道中的一种共栖菌，只在特定条件下侵入机体引起严重的全身性疾病[1]。区分临床中分离的HPS是“常驻菌”还是“致病菌”对HPS 病的诊断和控制尤为重要。“常驻菌”或“致病菌”特性的分析需要利用血清学以及基因分型技术。分型技术的优劣取决于方法的鉴定能力、重复性、花费时间以及成本等。对细菌菌型的鉴定有着不同的应用，地方流行病学中用判定一次疫情暴发涉及的菌株数量，而全球流行病学则关注特定菌株与其他地区以及不同时间分离株间的关系。因此，地方流行病学需要确定疾病暴发的病原菌为一株还是多株引起，或者在持续感染情况下确定是否由一种强毒株引起感染。全球流行病学则通过研究不同地区菌株间关系，分析菌株的全球分布以及导致分布差异的原因[1]。

HPS分离株在毒力、表型以及基因型特征等均表现出高度的异质性[1-2]。各地区分离株的血清型不同，毒力差异也较大。除血清型差异，同一种血清型不同地区分离株也存在毒力差异。而至今没有一种分型技术能够区分HPS分离株毒力以及对其准确的分型。本文就近年来血清学以及基因分型技术在HPS 病的流行病学以及毒力鉴定中的应用进行综述，为HPS分型、毒力鉴定以及流行病学研究等提供参考。

1 血清分型在HPS流行病学以及毒力鉴定中的应用

目前HPS 分为15 个血清型，各血清型之间的毒力存在很大差异，另有20 % 以上的分离株血清型未知。研究表明，血清型1、2、4、5、12、13 和14 以及不能分型的非典型菌株常分离于全身组织器官，而血清型3 和一些非典型株常分离于上呼吸道[3]。虽然血清型与毒力间存在一定的相关性，但也不尽然，因为即便是同一血清型的不同菌株也可表现出不同毒力。此外，不同血清型甚至同一血清型间的交叉保护力也存在差异或难以预料。

不同国家和地区流行的HPS血清型存在差异。采用免疫琼脂扩散试验，发现血清型4、5、12 和13 型在我国部分地区流行[4]。储岳峰等研究表明，菌株分离地区流行多血清型，4、5、12 型和不能分型菌株(含交叉反应菌株)为主要血清型，血清型13、10 和14 次之[5]。国外研究表明，美国、日本和西班牙等以血清4、5 型为主，德国以血清2、4 型最为流行，丹麦和澳大利亚以血清5、13 型为主。最近一项研究表明，北美地区流行的HPS血清型正在发生变化。血清4 型和一些不能分型菌株正逐渐流行，而血清5 型逐渐减少，并且血清学不能分型的菌株数量大量增加[2]。表明HPS在各地的流行株正在发生改变。

HPS的血清型已被普遍作为毒力标志。SPF 猪腹腔内接种血清型1、5、10、12、13 和14 后，在4 d 内猪发病或死亡，这些菌株归为高毒力菌株；血清型2、4 和15 接种后引起多发性浆膜炎但不致死，这些菌株归为中等毒力株；其它血清型(3、6、7、8、9 和11)接种SPF 猪后不引起临床症状，被认为无毒力[6]。对HPS分离株研究表明，分离于呼吸道和体内组织的HPS，血清型2、4、5、12、13 和14 在数量上大致相等[1-2]。最近北美的流行病学调查表明，体内分离的可疑致病性HPS为血清型1、2、4、5、12、13 和14 或者无法分型[3]。从健康猪上呼吸道分离的菌株在遗传上为同源(不同于分离自体内组织的细菌)，并且以血清型3 和无法分型菌株为主[3]。全国8 个省份主要流行菌株均为高毒力或中等毒力菌株，结合临床资料分析，全身性组织器官中HPS 分离率(45/62)明显高于呼吸系统组织中HPS 分离率(17/62)[5]。从全身性感染部位分离的菌株具致病性，而从呼吸道分离的菌株致病性有待确定。所以临床分离HPS 时应选择全身性组织器官而非呼吸系统组织。Zhang 等研究表明，血清型5 和4 是流行菌株，分别占23 %和17 %，不可分型菌株占20 %[7]。有研究采用豚鼠试验对分离株进行毒力株和非毒力株筛选，然后研究毒力菌株以及非毒力菌株对断奶仔猪的毒力和致病性。结果表明，临床发病猪场分离的HPS接种6 周龄HPS 抗体阴性商品断奶仔猪，可以使猪在4 d 内发病和死亡，但各血清型间以及同一血清型不同菌株间毒力存在差异。血清5 型毒力强于4 型和12 型，仔猪感染4 型、12型强毒株死亡数高于其弱毒株，但豚鼠试验筛选出的血清5 型强毒株和弱毒株对仔猪毒力无明显差异。3 个血清型强毒株均造成仔猪24 h 内急性死亡，急性死亡猪无明显病理变化，但超过24 h 死亡猪，均可见典型临床症状和病理变化[8]。

HPS的15 种血清型标准株对小鼠进行攻毒试验表明，血清型1、2、5、10、12、13 和14 接种BALB/c 小鼠死亡数最多，证明这7 个血清型毒力强；血清型4、15 接种BALB/c 小鼠死亡较少，显示这两个血清型毒力次之；血清型3、6、7、8、9 和11 接种BALB/c 小鼠均未死亡，表明这几个血清型毒力弱[9]。该结果与国外研究基本相符。Kielstein 等证明，血清型2 为中等毒力菌株，而在贺云霞的研究中显示血清型2 为强毒株，分析结果不一致的原因可能与菌株活力以及使用的实验动物有关[6]。

以上的研究均表明，血清型与毒力间虽然存在一定相关性，但二者并非简单的一一对应关系。因为即便同一血清型的不同菌株也可表现出不同毒力。同时临床中还存在部分毒力较强菌株采用血清学不能分型。在流行病学研究中发现血清学分型不能提供足够的分辨力，大概15 %～41 %分离株不能用血清学分型。巴西国内分离菌株分析表明，以高毒力血清型5、13 和14 以及血清4 型为主，其中血清型4 占到26 %，39 %的菌株不能分型[10]。这些都表明血清分型在流行病学中对细菌分型存有局限性。

2 基因分型技术在HPS流行病学以及毒力鉴定中的应用

大量研究表明，血清分型法不能很好的对HPS 临床分离株进行分型。目前，HPS 中毒力有关基因分型技术主要包括肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)、限制性片段长度多态性PCR(RFLP-PCR)、多位点序列分型(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、单基因座序列分型等。但这些技术都必须通过大量临床分离株验证其在毒力鉴定中的分辨能力。

2.1 ERIC-PCR ERIC-PCR 技术根据非编码区重复序列设计引物，扩增细菌基因组中未知序列并产生具有菌株特异性的指纹图谱而区分不同型细菌。该技术的特点是细菌基因组进化中由于缺失以及插入一些移动元件而形成。由于ERIC-PCR 技术具有及时、价廉、能追溯感染源头和对引起疫情涉及的不同型菌株数量进行确认等特点，非常适合对HPS 病疫情暴发的诊断。

研究表明，从全身性组织分离的Hps 指纹图谱表明均来源于同一型菌株，而与分离于其它非全身性组织或标准株的指纹图谱不一致。并且只有少部分菌株与疾病暴发有关，并且与暴发疾病有关的菌株图谱与上呼吸道分离的菌株图谱不一致。同样，关于全身性组织分离的HPS 与分离自肺部的菌株指纹之间存在相关性也颇受争议。该研究还利用限制性内切核酸酶分析法(REP)、全菌细胞分析、外膜蛋白表型分析、多位点酶切电泳分型技术等证明Hps菌株的高度异质性结论。研究表明，在同型菌株间和非典型菌株中存在高比例的基因多样性。尽管基因分型目前在学术界还未取得一致同意，但基因分型在预测HPS亚型中得到认可。由于ERIC-PCR 图谱具有高变异性，因此有些结果不同实验室不能共享。尽管如此，相对于REP 技术，ERIC-PCR 技术更方便。REP 技术要求较高并且比较复杂，有时需要对100 多条带型进行分析[11]。

Rafiee 等对HPS进行鉴定时发现，15 株参考菌株都形成了独特、可重复的ERIC-PCR 图谱。从3 个相关疫点获得12 株分离株显示相同的指纹图谱，与15 株参考株及两株澳大利亚分离株的图谱不同。12 株分离株同为一种指纹图谱，表明不同的农场存在共同传染源[11]。该研究第一次证实，ERIC-PCR 是一种适合研究HPS 病流行病学暴发的图谱分型技术。Turni 等研究澳大利亚昆士兰一个农场是否感染HPS时采用ERIC-PCR 分型、间接血凝和凝胶扩散血清分型等分析HPS分离株。获得的42 株中共有3 种基因型，而4 株分离株具有相同的典型图谱，但不能采用Kielstein/Rapp-Gabrielson 分型法进行区分[12]。提示实验室诊断应考虑这种情况，或者使用表型特征进行可疑HPS的鉴定。Macedo 等进一步应用ERIC-PCR 对巴西猪场中分离的63 株HPS 进行鉴定，共发现了33 种基因型，其中鉴定出8 种血清型，血清4 型最常见(15.9 %)，60.3 %的分离株为未分型菌株[13]。研究还表明，分离部位与基因型以及血清型间不存在明显关联性。

贾爱卿等对47 株HPS 进行分析，获得28 种不同的指纹图谱，分离自同一猪场和相同血清型菌株表现出不同指纹图谱，不能进行血清分型的HPS也可得到分型。另外发现血清5 型和12 型所有菌株DNA 指纹比血清4 型多出1 条约500 bp 片段。血清5 和12 型均为强毒力菌株，而血清4 型为中等毒力血清型，推测该500 bp 片段可能与毒力有关[14]。对分离自广西地区不同猪场的22 株HPS进行ERIC-PCR 指纹图谱分型，22 株分离株显示出12 种指纹图谱，可区分无法进行血清分型的菌株，表明ERICPCR 适用于对HPS进行分子流行病学调查及基因分型快速诊断[15]。

2.2 RFLP-PCR 近年，已建立了多种RFLP-PCR。通过扩增某一基因，然后对产物进行酶切后分析不同电泳图谱。该技术的优点是直接对临床样品进行PCR 扩增，不需分离细菌后再进行PCR 扩增。相对ERIC-PCR 而言，RFLP-PCR 重复性高，因为RFLP-PCR 要求的条件较严格。但由于RFLP-PCR 是对单个基因进行扩增，所以易受横向基因转移影响。

目前，利用了解较少的基因序列开展了3 种检测HPS菌型的RFLP-PCR 技术。扩增的基因包括转铁结合蛋白(tbpA)，16S rRNA 以及5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(aroA)等[16-17]。采用tbpA 和16S rRNA 基因的RFLP-PCR技术证实HPS间的高度异质性，并且还证实基因型与血清型间缺乏明确的关联。此外，还有部分血清型采用RFLP-PCR 技术难以区分。

RFLP-PCR 技术采用非种特异性PCR 扩增HPS和一些放线杆菌属成员的aroA 基因，因此在使用该基因分型技术时，对细菌进行分离和鉴定极其重要。有些HPS株具有与胸膜肺炎放线杆菌一样的RFLP 图谱，尽管导致这一结果的原因不清楚，但横向基因转移不能忽视。Redondo 等在特异性PCR 试验基础上，优化了HPS的RFLP 技术[16]。扩增tbpA 后采用Taq I,Ava I 和Rsa I 等限制性内切酶对tbpA 基因进行酶切，15 种HPS 参考株得到12 种图谱，而101 株分离株显示出较高的异质性(33 个RFLP 组)。Río 等首次报道了猪链球菌、HPS、李氏放线杆菌、马放线杆菌、豚放线杆菌、罗氏放线杆菌、猪放线杆菌、脲放线杆菌、小放线杆菌和吲哚放线杆菌中aroA 基因的存在，并且建立的基于aroA 基因的PCR-RFLP 方法表明HPS和放线种属aroA 的遗传多样性基本一致[17]。

Li 等利用相同的3 种酶对15 株HPS标准株tbpA 基因进行酶切，获得9 种图谱。同时，对50 株临床分离株分析后得到13 种图谱。DBN(38 %)，ABN(18 %)和DBP(12 %)等3 种RFLP 图谱为中国流行类型。研究还表明，主要基因型菌株分离于多发性浆膜炎或关节炎病猪中，但基因型与毒力间的关系不明确[18]。在HPS的诊断以及控制中，区分分离的HPS是常驻菌还是致病菌非常重要。此外，由于动物体内往往不止一种HPS定植，因此临床病例中分离的HPS可能并不是导致发病的致病菌。他们的研究还发现，有些仅表现为关节炎或无明显肉眼病变的病猪肺脏中也能分离出HPS。因此，临床中很难确定有明显症状和肉眼观察有病变的病猪，是由于HPS感染所致还是感染其他病原菌而发病。要证实分离的HPS是否为病原菌，只有通过本身不携带HPS的健康猪，接种HPS观察能否引起与HPS感染后相同的临床病变进行判定。

基于ompA 基因建立的PCR-RFLP 技术对15 株参考株和49 株分离株进行分型，64 株被分为8 种不同基因型，其中7 种基因型(包括AA、BB、BA、CA、BC、BD和CD)同时存在于参考株和分离株中，而基因型CB 仅存在于分离株。此外，BA、CD 和CA 仅存在于病猪中，健康猪中分离的菌株为AA、BB、BC 和CB 型[19]。研究表明，相同血清型分离株RFLP 图谱不一致，同时具相同RFLP 图谱分离株却属于不同血清型菌株，表明基因型和血清型没有必然的联系。该研究还表明该方法适合对流行病学中菌株类型的研究。

Jabloński 等发现PCR-RFLP 和ERIC-PCR 在HPS分型中均具有较高分辨能力。在结果相近情况下，考虑到方法的复杂性，ERIC-PCR 优于PCR-RFLP[20]。巴西40 株从猪体内分离的HPS进行RFLP 分析表明，40 株有34 种图谱型，相似性在0.2 到1.0 之间，分辨率为0.97[10]。表明对不同血清型采用RFLP 分析具有较高的分辨能力。

彭昊等探索了PCR 方法及PCR-RFLP 技术对aroA 基因在HPS 病原检测及基因分型中的作用[21]。虽然菌型与血清型分类无直接对应关系，但结合菌株毒力试验结果发现，毒力较强菌株聚为一类。并且与毒力相对较弱的菌株相对比，毒力较强菌株的aroA 基因编码序列大多存在Hin d Ⅲ酶切位点，作者推测该酶切位点处碱基的变异可能导致毒力改变。刘辉等通过3 种限制性内切酶TaqⅠ、AvaⅠ、AfaⅠ对Hps 的tbpA 进行PCR-RFLP 分型[22]。结果表明，5 株HPS得到4 种基因型，分别为EBC、BBJ、EBJ、EAD。在未分离细菌情况下，PCR-RFLP 基因分型用于菌株的描述和比较是可行的,但这种方法的区分能力不及ERIC-PCR 方法。

2.3 MLST MLST 是最近提出的一种HPS 基因分型方法。MLST 在其他细菌分型中得到广泛应用。MLST 具有可重复性、易于共享和具有较高分辨能力等优点，但由于需要较高的测序成本，所以限制了其常规应用。最近研究表明，以测序为基础的分型技术很可能成为未来全球流行病学研究的技术选择。当应用于鉴别不同菌株间的关系时，序列分型法可提供高水平的鉴别能力。此外，MLST还有助于寻找基因型与毒力以及交叉免疫力之间的关系。

MLST 分型法根据细菌基因组中7 个管家基因mdh、6pgd、atpD、g3pd、frdB、infB 和rpoB 在菌株之间的多态性而建立的基因分型方法。Olvera 等对11 株Hps 标准菌株和120 株临床分离株进行分析获得109 种序列类型，系统进化树分析得到1、2 两个分支。分支2 菌株高度相似，大多数为与临床病理损害相关的假定有毒菌株，提示这可能是一个毒力增强的谱系；分支1 则多数为鼻腔分离株，只有少数为可能的潜在有毒力菌株[23]。MLST 证实Hps 菌株间的高度遗传异质性。MLST 分型法克服了传统血清分型的低分辨率和ERIC-PCR 技术存在的不同实验室间难于进行比较的缺陷，并能提供更多的关于DNA 方面的信息，但MLST 需进行基因序列测定，成本昂贵。Aragon 等研究表明，菌株的毒力并不完全与血清型以及MLST 分类结果相吻合。他们认为，血清型不能决定菌株的毒力，可能还存在其他毒力相关因子因素造成毒力差异[24]。

HPS基因组测序为MLST 技术优化提供了依据。利用已发表的HPS序列(菌株29755 和SH0165)，Mullins 等对已有引物进行重新设计，建立了改良的MLST 分型方法[25]。对127 株菌株进行研究，7 个看家基因序列中确定了278个变异位点，定义了116 个独特的序列类型。对比改良与传统分型技术，表明在所有基因位点多态性中分辨率无差异。优化的MLST 数据被用于充实新创建和公开的HPS数据库。MLST 数据库为HPS的暴发调查和跟踪演化提供了一种新的资源。同时发现血清型1、5 和15 与毒力间的对应关系强于其他血清型。血清型5 和15 聚类在高毒力分支2 中，而血清型1 则全部聚类在既有毒株又有无毒力株的分支1 中，表明基因分型结果与血清型以及毒力间关系不是绝对一致。Turner 等也明确表示，MLST 技术能判断分离株属于何种菌型，而不能准确辨别该分离株毒力，表明MLST 分型与毒力间存在不一致性[26]。

国内学者对86 株HPS的7 个看家基因扩增后测序，经MLST 分析发现，分离株存在高度遗传异质性，86 株菌株分成74 个类型[27]。最近研究也表明，7 个看家基因均存在不同程度变异，平均变异率为52.4 %。分离于同一个猪场同一头猪的分离株，基因型也存在差异[28]。

2.4 PFGE 将细菌包埋于琼脂块中，利用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下得到良好的分离。PFGE 中内切酶的选择至关重要，采用的内切酶常为寡切点酶，酶切后片段少而大，适合于PFGE 电泳分析。

徐成刚等从52 株耐至少7 种抗菌药物的菌株中提取DNA 进行分析，确定了46 个不同的PFGE 模式。被检测的耐药HPS间的不同变化表明抗性性状由各菌株独立获得。此外，利用PFGE 对携带四环素耐药基因的华南分离菌株分析表明，18 株携带tetB 基因的HPS分为17 种基因型，大部分菌株指纹图谱不一致，表明这些菌株间呈现明显的遗传多样性，但有两株菌株(SC112 和SC113)的图谱完全一致，表明这两株菌株具有克隆传播关系[29]。

Zhang 等应用CpoI 对传统PFGE 方法进行改进，并用于47 株分离株和15 株标准株。结果表明建立的方法能够有效的区分临床分离株[30]。他们进一步采用已建立的方法分析112 株HPS，结果表明，可分型的89 株显示为63 个不同图谱，血清型不可分型的23 株显示出22 种不同图谱。同时发现部分同血清型菌株具有相同PFGE 图谱，表明PFGE 图谱与血清型间存在一定的相关性[7]。2012 年，Castilla 等首次采用NotⅠ对HPS进行酶切后进行PFGE，获得20 种不同图谱类型，分辨率达0.95，表明具有高重复性以及良好的分辨力[10]。

2.5 单基因座序列分型 由于对HPS细菌簇之间的关系知之甚少，并且各实验室得到的结果难于比较，使得指纹图谱法在全球流行病学研究中的应用受到限制。最近，Olvera 等研究hsp60 的部分序列在HPS流行病学中的应用。91 株被检菌中鉴定出36 个等位基因，同时多株HPS被归入两个主要簇内。其中一个簇多数为临床分离株和强毒参考株，但未检测到毒力和基因型间的相关联系[31]。这项研究工作还对16S rRNA 进行序列分析，发现该基因在亚种水平上具有高度多样性。

Dijkman 等研究表明，血清型与ERIC-PCR 聚类分析以及Hsp60 序列分型之间不存在相关性，但ERIC-PCR 和Hsp60 分型适合作为分子流行病学的标记[32]。最近，Howell 等对编码荚膜多糖序列分析，15 个血清型中除血清型5 和12 外，都有一个独特的区域(区域2)，该区域可进行HPS分型研究[33]。

3 小结与展望

目前基于抗血清和表面抗原将HPS分为15 个血清型。但这些方法都发现临床中有很多菌株不能分型或不同方法分型差异较大。虽然多种基因分型方法被广泛用于Hps分型以及毒力鉴定中，但由于对HPS完整基因组序列以及毒力因子的认识不足，至今没有一种分型技术能够准确区分HPS分离株毒力。血清型以及基因分型技术在分析HPS致病性与血清型和基因型间的关系都面临挑战。随着高通量测序的发展，越来越多HPS序列公布，这必将从基因水平上区分致病性与非致病性HPS提供依据。相信随着HPS序列的破解和生物信息学的发展，新的基因分型技术以及毒力和非毒力菌株间特有的差异基因的发现，并通过大量临床分离株验证其在毒力鉴定中的分辨能力。基于主要毒力因子而建立的基因分型技术，必将成为HPS 流行病学以及毒力鉴定中的重要工具。

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