乳腺生物反应器研究进展

包梦醒，吴 新

（1.苏州市产品质量监督检验所 ，江苏 苏州215000；2.苏州出入境检验检疫局，江苏 苏州215000；3.苏州世标检测技术有限公司，江苏 苏州215000）

从细菌基因工程到细胞基因工程，再发展到转基因动物，科学家一直在努力探索生产药用蛋白的更好方式。细菌结构简单，操作简单，但缺乏翻译后加工机制，表达的重组蛋白需经修饰才有活性，增加了生产的成本和工艺复杂性；哺乳动物细胞具有转录后加工修饰能力，但培养条件苛刻，难以实现规模化生产。1980年，第一只转基因小鼠出现，让科学家们将生产药用蛋白的希望转向转基因动物。

在转基因动物体内最理想表达蛋白的场所就是乳腺，自从1987年Gorden首次成功地从转基因小鼠的乳汁中获得了人类组织型溶酶原激活剂tPA以来［1］，乳腺生物反应器就成为各国科学家研究的热点。美国的GTC公司、英国的PPL公司以及荷兰的Pharming等公司投入大量资金研发乳腺生物反应器生产药用蛋白，目前已经生产出100多种药用蛋白，很多都已经进入临床阶段。2006年和2009年，GTC公司用山羊乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶Ⅲ（ATryn）分别被欧洲药监局EMA和美国FDA批准，成为第一个被批准上市的转基因动物生物反应器生产的药物；2010年，荷兰Pharming公司用转基因兔生产的单克隆抗体药物Ruconest，成为第二个获得欧洲药品管理局批准转基因动物生产药物。本文主要从乳腺生物反应器的概念、原理、特点、主要的转基因技术及问题等进行综述，以期为乳腺生物反应器的相关研究提供参考。

1 乳腺生物反应器的概念及原理

乳腺生物反应器（mammary gland bioreactor）亦称为转基因动物乳腺个体表达系统，是指利用哺乳动物乳腺特异性启动子调控元件指导目的基因在乳腺中特异性表达，以期从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器［2］。乳腺生物反应器的原理主要是利用雌性动物产仔后乳腺分泌乳汁的特点，利用乳蛋白基因的乳腺特异性调控成分驱动外源基因在动物乳腺中高效表达，从而在乳汁中源源不断获得外源性蛋白。

2 乳腺生物反应器的特点

转基因生物反应器主要包括乳腺生物反应器、血液生物反应器、膀胱生物反应器、家禽生物反应器等，与其它转基因生物反应器相比，乳腺生物反应器具有很多特点：

①乳汁是动物分泌的天然产物，经常收集不会对动物造成健康损害；②产量高，以一头奶牛产奶量10 000kg／年，蛋白含量3%，转基因生产的蛋白占总蛋白的1%对于药用蛋白来说产量是非常可观的；③成本低，转基因动物产奶是农业化生产过程，生产、管理成本都较现代生化制药低；④乳腺分泌药物蛋白，能对蛋白进行糖基化、脂化、磷酸化、羧化等修饰加工，产物更接近天然产物；⑤乳腺生物反应器一般生产蛋白就在乳腺系统，对其它动物身体系统几乎不产生负面影响；⑥纯化简单，乳汁中蛋白种类较少，目的产物易纯化。

3 乳腺生物反应器主要转基因技术

乳腺生物反应器的构建过程主要包括以下几个步骤：首先分离和改造目标基因，将目的基因与乳蛋白基因的启动子结合，构建表达载体，将融合的基因注射到受精卵或者多潜能干细胞（ES细胞［3］、iPS细胞［4－5］等），再植入受体动物，使其怀孕产下能表达药物蛋白的转基因幼仔，最后使转基因幼仔怀孕繁殖下一代，扩大转基因种群。下面对涉及的关键步骤和技术进行简单介绍。

3.1 构建表达载体

3.1.1 目的基因 从1987年从小鼠中获得人类组织型溶酶原激活剂tPA以来，一百多种目的基因在乳腺生物反应器中获得表达，AT－III、AAT、蛋白C、乳铁蛋白、乳糖酶、干扰素、胰岛素、血清白蛋白等产物都已经成功获得。理论上将，大部分蛋白质都可以通过乳腺表达，但是因为乳腺生物反应器的特点，更适合生产正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其他表达体系难以表达或者表达量低、临床用量较大的药用蛋白。

3.1.2 调控序列 外源基因如果要在乳腺生物反应器中高效表达需要同时满足两个条件：一、目标产物能高效、特异地获得表达并分泌到乳汁中，乳腺的特异表达序列成为研究的重点；二、构建的表达载体要处于开发和活跃的状态。传统表达载体一般选用某种乳蛋白基因的调控序列作为调控序列的核心元件，主要有β－酪蛋白基因 （BLG）基因、αS1－酪蛋白基因、β－乳球蛋白、乳清酸性蛋白基因（WAP）以及乳清白蛋白基因。反刍动物一般采用同一物种的启动子，并以BLG最多；家兔、猪和鼠类则采用多采用啮齿类WAP；不同乳蛋白调控元件也可以混用。

表达载体的构建一般有几种类型：一、基于普通质粒的表达载体，主要包括启动子、增强子、激素应答区、位点控制区、核基质黏附区、5＇和3＇非翻译区、PolyA位点等调控元件，但是人工雕琢的痕迹明显，容量较小，是早期研究较多的载体类型；二、基于酵母人工染色体的表达载体，酵母人工染色体（YAC）是新的大容量载体，主要包括着丝粒、端粒、复制原点。YAC的构建使在整个独立转录单位内插入外源基因成为可能，保持了乳蛋白调控的天然状态。三、基于基因敲入的表达载体，有时外源基因插入着丝粒这一类异染色质区时，往往造成表达载体处于压缩状态，转录因子根本无法接近。即使调控序列有效，外源基因也无法表达。这种现象叫作位点效应，即转基因动物基因组中表达载体插入位点的邻近序列对外源基因表达的影响［6］。基因基因敲入的表达载体主要指基因打靶，将带启动子的外源基因敲入一些开放的、活跃转录的位点，对克服位点效应有重要作用。

3.2 转基因技术

目前制备乳腺生物反应器的主要技术有原核显微注射技术、反转录病毒感染技术、精子介导的转基因技术、胚胎干细胞介导技术等，各有优势也各有其局限性。

3.2.1 原核显微注射技术 原核显微注射技术是1980年由Gordon［1］等创建的经典技术，主要是将目的基因直接注射到受精卵原核内部。优点：①外源基因分子大小基本不受限制；②操作相对简单，转基因个体整合率高，在双原核注射时整合目的基因的小鼠能达到50%［7］；③研究较早，技术较成熟，已经在小鼠、家兔、猪、山羊、绵羊等多种动物上获得成功。缺点：①设备昂贵，成本高；②整合位点随机，效率低、可能破坏重要的内源基因，易导致所需基因失活或胚胎死亡；③不能再早期确定转基因动物的性别，增加工作量。

3.2.2 逆转录病毒感染技术 逆转录病毒感染技术主要是逆转录病毒在逆转录酶的作用下，逆转录为双链DNA再整合到宿主染色体上，实现转基因操作。Breme［8］和Schatten［9］等利用该技术获得了转基因奶牛和转基因猴。优点：①目的基因整合有序且较稳定；②拷贝数和插入位点相对固定，在牛等某些特定动物上效率较高；缺点：①对插入的目的基因大小有限制；②插入有一定随机性，容易产生嵌合体。

3.2.3 精子介导的转基因技术 主要包括精子载体技术和胞内精子注射技术。精子载体技术还未得到大多数科学家的认可，这个技术的原理主要是精子质膜能结合DNA，反对者主要认为如果精子吸收DNA如此简单的话，物种不可能这么稳定地代代遗传。CHEN等利用脂质体介导的精子载体技术，获到了表达GFP基因的家兔［10］。胞内精子注射技术是由Perry等人首次提出，首先用去污剂、冻融或冻干等方法处理精子，和目的基因共孵育后注射到MⅡ期卵母细胞质。操作及原理与显微注射类似，但纯合后代较多，目前只在小鼠中获得了成功。

3.2.4 胚胎干细胞介导技术 胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）是一种从早期胚胎的囊胚内细胞团（Inner Cell Mass，ICM）细胞或胎儿原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）经分离、体外抑制分化培养得到的具有发育全能性 （或多能性 ）的细胞［11］，具有不断自我更新和高度分化潜能的特点。胚胎干细胞介导技术主要是用外源基因转染ES细胞，通过筛选、富集再转移进囊胚，并转移到个体内进行培养获得转基因动物。该技术的优势主要有：①能提前确定性别并进行筛选；②能对基因进行加入、剔除或者替换等修饰。但是，目前该技术只在小鼠和大鼠上获得成功，牛、羊、猪等大动物的乳腺生物反应器还未成功。近年来，干细胞研究领域不断获得新的研究成果，1999年发现了成体干细胞具有跨系跨胚层分化的“可塑性 ”；2006年，Takahashi和Yamanaka首次利用小鼠皮肤成纤维细胞成功获得类似胚胎干细胞（embryonicstemcells，ES细胞）的多能干细胞［12］，命名为诱导多能干细胞 （induced pluripotent stem cells，iPS细胞 ），具有和ES细胞几乎一样的生物学特性，为牛、羊、猪等大动物的乳腺生物反应器的建立提供新思路。

3.2.5 基因打靶技术 基因打靶技术主要是利用外源基因与细胞基因组同源序列发生同源重组，对细胞基因组进行定点修饰的技术，实现对外源基因的定点整合。基因打靶法制备乳腺生物反应器相比早期的显微注射法，具有定位准确和能对内源基因修饰等特点。

根据打靶对象细胞的不同，可分为胚胎干细胞介导的基因打靶技术和体细胞介导的基因打靶技术。利用小鼠ES细胞的基因打靶技术现已成为一种常规技术，但目前利用ES细胞基因打靶技术对大动物的乳腺生物反应器的研制还未成功。2009年，青岛森淼生物技术有限公司与青岛森淼生物技术研究所研发的我国首个利用乳腺生物反应器生产的抗凝血酶Ⅲ蛋白纯品研究成果通过国家级项目评估。该研究主要是采用基因打靶技术制备乳腺生物反应器，将药物蛋白基因定点整合到山羊内源的乳腺蛋白基因中，在国内首次获得药用蛋白转基因体细胞克隆奶山羊，构建成功3种重组药用蛋白乳腺生物反应器，使我国成为继美国GTC公司之后，世界上第二家拥有该技术的企业。

3.2.6 体细胞核移植技术 体细胞核移植技术的核心技术是克隆技术，主要是将目的基因转移到培养细胞中，筛选出整合有目的基因或获得相应的遗传修饰的细胞后，克隆转基因细胞系，然后将细胞核移入去核的卵细胞中，获得的重构胚移入代孕母体，从而获得转基因个体。1997年，Schnieke等首次通过细胞核移植技术获得表达凝血因子的绵羊乳腺生物反应器［13］。与经典显微注射法相比，具有效率高、生产周期短，预先决定性别，易于与基因打靶技术结合等优势。基因打靶技术的定点整合技术理论上能够克服显微注射技术的位置效应的缺点，这两种技术相结合具有基因定点整合、高效特异性表达等优势，是未来乳腺生物反应器转基因技术的发展方向。2000年，McCreath等通过基因打靶技术和核移植技术相结合，成功培育出乳汁中hAAT表达量0.65mg／mL的转基因绵羊［14］。

3.3 纯化技术

分离纯化是乳腺生物反应器研制成功后，投入规模化生产的下游关键步骤。因为目标种类的多样性，所以分离纯化对于特定的产物可能采取不同的分离步骤和方法。白倩等以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质，合成了不同配基密度的SP（Sulfopropyl，磺酸基）离子交换介质，建立了乳腺生物反应器表达重组人乳铁蛋白（Recombinant Human Lactoferrin，rHLF）的纯化方法［15］；李由等通过重组蛋白和主要牛蛋白杂质的物化性质，计算制定了纯化工艺 路线；采用硫酸铵沉淀去除IgG蛋白，进一步通过疏水层析的条件优化分离同源LA蛋白得到重组人乳清白蛋白纯品［16］。田阳等以离子交换、疏水作用、HPLC和凝胶过滤层析等方法对山羊乳腺生物反应器表达的人促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）进行分离纯化并获得96%以上的纯品［17］。

4 问题和展望

虽然近年来乳腺生物反应器的研究取得很多突破性进展，但是它作为一个不太成熟的新兴产物还存在很多问题。①转基因动物前期研究投入大，成功率较低；②外源基因的改造及克隆等转基因技术还不够成熟；③目的基因的表达水平总体不高，表达量低，受位置效应制约；④获得的目标蛋白与自然活性蛋白可能存在一定的差异性，后期的分离纯化技术还不成熟；⑤转基因方式获得的蛋白对人体是否会产生不良影响也未可知。尽管乳腺生物反应器这种新型转基因技术还存在各种缺陷，随着研究的深入，转基因技术的不断完善和开发，我们有理由相信在不久的将来，乳腺生物反应器必将获得成功和产业化，对人类的生活和生产产生巨大的影响。

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