淫羊藿苷通过降低MMP-9抗自发性高血压大鼠心室重构*

王颖婉，李叶丽，李意奇，张丽梅，徐尚福，杨丹莉

(遵义医学院 药理学教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义 563099)

心室重构可见心肌细胞肥大、凋亡、心肌细胞外基质(ECM)堆积，胶原量增加，胶原网受到破坏，心肌组织纤维化等，表现为心肌肥厚、心腔扩大、心脏的收缩和舒张功能障碍。心室重构是导致心力衰竭的关键因素，是心脏疾病走向终末期的一个必然阶段[1]。因此，防治心室重构已成为近年来研究的热点。由于ECM的降解依赖基质金属蛋白酶(MMPs)，所以MMPs在心室重构的过程中发挥着重要的作用[2]。

淫羊藿具有“补肾阳，祛风湿，益气力，强心力”等功效。淫羊藿苷(Icariin，Ica)是淫羊藿的主要活性成分之一，具有降血压、抗肿瘤、增强免疫力、调节内分泌及抗骨质疏松等作用[3]。本研究拟观察淫羊藿苷是否具有抗自发性大鼠心室重构的作用，及该效应是否与MMP-9有关。

1 材料与方法

1.1 动物 14周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)，14周龄同源正常的京都大鼠(WKY)，SPF级，体重260～300 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2012-0001。

1.2 试剂及仪器 淫羊藿苷(纯度 ≥ 98 %)购于南京泽朗医药有限公司；RNA 逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司； MMP-9、TIMP-1 mRNA引物由宝生物工程(大连)有限公司合成；real-time RT-PCR 扩增仪，美国BIO-RAD 公司；通用酶标仪，美国BIO-RAD 公司。

1.3 分组及给药 21只14周龄雄性SHR大鼠随机分为模型组、Ica低剂量组(20 mg/kg)、Ica高剂量组(40 mg/kg)，每组7只，7只WKY大鼠为空白对照组。所有大鼠适应性喂养1周后，Ica低、高剂量组灌胃给药，每日2次，至26周龄，空白和模型组给予等体积双蒸水，实验结束后处死全部动物，取标本备用。

1.4 观察指标及检测

1.4.1 大鼠血清中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的检测 采用ELISA方法检测大鼠血清中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。腹主动脉取血2 mL，置于促凝管中，离心后取上清，稀释标准品、加样、温浴、洗涤、加酶、洗涤、显色、测定。计算出大鼠血清中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。

1.4.2 病理学观察 取各组大鼠心脏组织，置于10%福尔马林固定48 h后，经脱水、包埋、切片和HE染色，观察心肌形态学改变。

1.4.3 心肌组织中MMP-9、TIMP-1因子 mRNA的表达 每组各取心脏标本7例，采用real-time RT-PCR法检测。MMP-9、TIMP-1的mRNA 序列引物，由宝生物工程(大连)有限公司合成(见表1)。目的基因表达相对定量法：以PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需的循环数(cycle threshold，Ct值)为统计参数，依次计算平均Ct值=(Ct1 + Ct2)/2(重复管)；dCt =平均Ct值-中间值；基因的表达=2-dCt；相对定量=目的基因的表达/内参基因的表达×100，将空白对照组的mRNA 表达量设定为100。

表1用于Real time RT-PCR的引物序列

基因基因库编码上游下游MMP-9NM_031055.1AGCCGGGAACGTATCTGGATGGAAACTCACACGCCAGAAGTIMP-1NM_053819.1CATCTCTGGCCTCTGGCATCCATAACGCTGGTATAAGGTG-GTCTCβ-actinNM_031144.2GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGACTCATCGTACTCCTGCTT-GCTG

2 结果

2.1 各组大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的结果 与空白组WKY大鼠相比，模型组SHR大鼠的Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显上升(P<0.01)，与模型组相比，Ica低、高剂量组的Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显下降(P<0.01或P<0.05)，且Ica低高剂量组间无差异。

组别Ⅰ型胶原(nmol/L)Ⅲ型胶原(nmol/L)空白组3.30±0.177.01±0.74模型组3.92±0.38**13.71±3.76**Ica低剂量组(20 mg/kg)3.34±0.22#6.61±1.08##Ica高剂量组(40 mg/kg)3.41±0.20#8.15±1.36#F3.4437.138

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 病理学观察 HE染色显示，与空白组相比，模型组心肌细胞肥大、延长，排列紊乱，胶原聚集，血管周围纤维化和心肌间质纤维化明显增加。与模型组相比，Ica低、高剂量组心肌细胞排列较整齐，血管周围纤维化及间质纤维化均减轻(见图1)。

注：A：空白组；B：模型组；C：低剂量组；D：高剂量组。 图1 淫羊藿苷对SHR大鼠左室心肌病理学的影响(HE× 200)

2.3 心肌组织中MMP-9、TIMP-1因子mRNA的表达 与空白组相比，模型组MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达明显上调(P<0.01)。与模型组相比，Ica低、高剂量组MMP-9 mRNA的表达明显下调(P<0.01或P<0.05)，TIMP-1 mRNA的表达明显上调(P<0.01或P<0.05)，且Ica低高剂量组间无差异(见表3)。

组别MMP-9TIMP-1空白组100±14.14100±9.38模型组255.21±11.45**150.64±5.83**Ica低剂量组(20 mg/kg)173.96±12.32#275.06±17.98#Ica高剂量组(40 mg/kg)155.87±2.87##250.26±3.68##F7.713 21.291

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

SHR大鼠与人类原发性高血压的发病过程和机理非常相似，此鼠高血压自发率为100%，还能继发高血压性心血管病变。WKY大鼠是SHR大鼠同源血压正常的京都大鼠。有研究表明，SHR大鼠在24周龄时即可明显发生血管周围纤维化和间质纤维化[4]。本研究中14周龄雄性SHR大鼠喂养至26周龄，模型组大鼠血清Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显上升，病理学HE染色结果显示心肌细胞肥大、延长，排列紊乱，胶原聚集，血管周围纤维化和间质纤维化，可认为心室重构模型制模成功。而Ica低、高剂量组给药至26周龄时，心肌细胞排列较模型组整齐，血管周围纤维化程度及间质纤维化减少，大鼠血清Ⅰ、Ⅲ型胶原含量较模型组明显下降。因此，可以认为Ica具有抗自发性高血压大鼠心室重构的作用。

心肌中MMPs是特异性降解心肌细胞外基质(ECM)成分的酶家族，是影响心室重构的重要因素。有实验表明，MMPs的升高与左心室重构有密切的关系[5]。Spinale 等对37例扩张型心肌病患者进行研究，发现左心室MMPs 的含量较空白组高2倍。MMP-9是基质金属蛋白酶-9，又称明胶酶B，是MMPs中分子量最大的酶。在纤维化早期MMP-9是分解ECM的主要酶，可引起ECM退化，导致心肌排列紊乱及收缩功能异常[6]。MMP-9除降解基质组分外，还能调控胶原合成，正常的胶原蛋白可被MMP-9分解，并被缺乏连接结构的纤维代替，最终纤维化增加伴随MMP-9升高[7]。本研究中，模型组大鼠MMP-9的表达明显升高，而Ica低、高剂量组大鼠较模型组MMP-9的表达均明显降低。提示Ica抗SHR心室重构的机制可能与降低MMP-9的表达有关。基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)，是MMP-9内源性抑制剂，通过与之结合，特异性抑制MMP-9的活性。有研究表明，增加TIMP-1的表达可减少成纤维细胞的形成[8]。本研究结果显示，Ica可明显增加TIMP-1的表达，减少心肌血管周围纤维化和间质纤维化的形成。但值得注意的是，模型组的TIMP-1表达也升高，这可能与MMP-9的显著升高，代偿性地激活TIMP-1有关，但随着病程的延续和加重，TIMP-1代偿性的升高并不能完全抑制MMP-9的表达。综上，Ica抗SHR心室重构的机制可能与降低MMP-9、升高TIMP-1的表达有关。

[参考文献]

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levels in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy [J] . Echocardiography，2010，27(8)：854-960.

[2] 商卓，王文. 基质金属蛋白酶与压力超负荷致心室重构的研究进展 [J]. 现代医学，2010，38(3)：324-327.

[3] 李利生，刘娟，王安斌，等. 淫羊藿苷对大鼠肝药物代谢Ⅱ相酶和药物转运体的影响. 遵义医学院学报[J]. 2012，35(1)：13-16.

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[5] 刘军锋，贾克刚，刘运德. 基质金属蛋白酶与心脏重构及心肌病理损害的研究进展[J].中国老年心血管病杂志， 2007，7(9)：499-500.

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