吴茱萸总碱抑制大鼠左室肥厚及对钙调神经磷酸酶信号通路的影响*

张婧怡，林淑娴，侯化化，李 强，徐 洋，孙安盛

( 遵义医学院 药理学教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义 563099)

心肌肥大是机体在心衰早期为维持正常心功能而发生的代偿性变化，持续的心肌肥大可引起心室重构，最终导致心功能失代偿发生心力衰竭[1]。心肌肥厚作为心血管疾病的主要危险因素之一，积极寻找抑制其发生发展的方法和药物始终是心血管疾病研究领域的热点。钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)是一种受钙调蛋白调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，Ca2+-CaN-NFAT信号通路是心肌肥大重要的信号传导通路，CaN激活其下游 T 细胞活化核因子3(nuclear factor of activated T cells，NFAT3)，最终导致心肌肥大的发生和发展[2]。

我国传统中药吴茱萸(Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.)为芸香科植物吴茱萸近成熟干燥果实，药用始于《神农本草经》，现代医学研究其具有广泛的心血管药理作用，如对离体豚鼠心脏具有保护作用[3]、逆转异丙肾上腺素诱导的心肌重塑[4]、抗血小板并降低ADP诱发小鼠急性肺血栓的死亡率[5]等。近来我室研究发现吴茱萸提取物对右室肥厚具有显著的抑制作用[6]。本实验采用大鼠腹主动脉缩窄所致心肌肥厚模型，旨在明确吴茱萸总碱对左室心肌肥厚的抑制作用及对钙调磷酸酶信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 主要药物与试剂 吴茱萸总碱(上海源叶生物科技有限公司，生产批号：201201211 )；L-精氨酸(美国Sigma公司)；戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司)；逆转录反应体系试剂盒(大连宝生物工程公司)；荧光定量PCR混和液(英国ABI公司)；β-actin、心房利钠因子( atrialnatriuretic factor，ANF)、CaN引物(大连宝生物工程公司)，引物序列(见表1)。

表1荧光定量PCR基因扩增引物序列

基因基因库序号Forward primer(5'-3')Reverse primer(5'-3')β-actinANFCaNNM031144NM012612NM017041GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTATGACAGGATTGGAGCCCAGAGCTGAGATGCAGGTAAACGTCCT-GAGACTCATCGTACTCCTGCTT-GCTGTCGAGCAGATTTGGCTGT-TATCTTCTGCTCGGATCTTGTTCCTGATG

1.2 仪器 BESN-Ⅱ多通道动物无创测压仪(南京德赛生物技术有限公司)；BL-420E型四道生理记录仪(成都泰盟科技有限公司)；Leica光学显微镜(德国Leica Microsystems Ltd)；实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

1.3 动物、分组及给药 雄性SD大鼠，清洁级，体重 200±10 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝))2012-0005。大鼠适应性喂养1周后，筛选血压正常大鼠60只，随机分为假手术组，模型组，吴茱萸总碱低剂量(10 mg/kg)组，中剂量(20 mg/kg)组，高剂量(40 mg/kg)组和L-arg(200 mg/kg)组，每组12只。大鼠造模次日灌胃给药，假手术和模型组灌胃等量蒸馏水。

1.4 模型制备 左室肥厚模型参照Grodzicki等提供的方法[7]，大鼠戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，打开腹腔，在双侧肾动脉的上方分离腹主动脉，将7号针头(去尖)连同腹主动脉一同结扎(假手术组大鼠不结扎)，结扎后随即抽出针头，造成大鼠腹主动脉部分狭窄，然后将内脏复位并缝合腹腔，每只大鼠肌内注射苄星青霉素10万单位预防感染。待大鼠清醒后分笼喂养，手术后第2天开始灌胃给药，连续4周，假手术组及模型组大鼠灌胃等容量生理盐水。

1.5 左室血流动力学参数观察 最后1次灌胃给药后，大鼠称重，戊巴比妥钠40 mg / kg腹腔注射麻醉并仰位固定，钝性分离右颈总动脉，经右侧颈总动脉逆行插入聚乙烯心导管至左心室，心导管末端通过压力换能器，连接生物机能实验记录仪，测定左室内压峰值(LVSP )、左心室舒张期末压(LVEDP)、左室等容收缩末期压力上升最大速率(+dp/dtmax)和左室舒张期压力下降最大速率(-dp/dtmax)。

1.6 左室肥厚指数的测定 处死大鼠后快速开胸摘取心脏，剪去心房与右室游离壁，保留左心室与室间隔，用滤纸吸去水分后称其湿重，即为左室重量(LVW)，左室重量/体重即为左室肥厚指数(left ventricular hypertrophy index，LVHI)。

1.7 心肌病理学观察 大鼠连续给药4周处死后，取出大鼠心脏，切取左室部分心肌组织，用10%甲醛液固定，石蜡包埋组织块后切片(厚度为3 μm)，经HE染色后于光镜下观察各组大鼠心肌病理学变化。

1.8 Real-time PCR检测左心室肌组织中CaN、ANF mRNA的表达 Trizol法提取左室心肌组织中总RNA，纯化后计算RNA含量及OD260/OD280nm比值，进行样品纯度鉴定。两步法进行逆转录- 聚合酶链反应，PCR反应体系为15 μL，第1步95 ℃×10 min；第2步95 ℃ × 15 s，循环40次，退火温度60 ℃×1 min。相对定量法分析PCR结果，以β-actin基因为内参，采用2-ΔΔCt 法计算CaN、ANF基因的相对表达水平。

2 结果

2.1 吴茱萸总碱对腹主动脉缩窄大鼠LVHI的影响 与假手术组相比，模型组大鼠LVHI明显增加(P<0.05)。与模型组比较，吴茱萸总碱20 mg/kg和40 mg/kg明显减轻腹主动脉缩窄所致LVW的增加(P<0.05)及LVHI的升高(P<0.05)，吴茱萸总碱10 mg/kg对大鼠LVW及LVW无明显影响(见表2)。

组别Dose(mg/kg)BW(g)LVW(g)LVWI‰ShamModelL-argETAETAETA200102040339.15±17.49283.75±21.28325.14±24.38313.28±29.46327.29±20.19320.35±19.550.54±0.08 0.81±0.11*0.60±0.13#0.83±0.15 0.69±0.06#0.68±0.10#1.59±0.25 2.86±0.19*1.84±0.22#2.69±0.15 2.13±0.18#2.15±0.21#

注：*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group。

2.2 吴茱萸总碱对腹主动脉缩窄大鼠血流动力学参数的影响 与假手术组比较，模型组大鼠LVSP及LVEDP明显高于假手术组(P<0.05)，而±dp/dtmax显著减低(P<0.01)。吴茱萸总碱10 mg/kg和20 mg/kg对LVSP及 LVEDP无明显影响，但吴茱萸总碱20 mg/kg能显著升高±dp/dtmax。吴茱萸总碱40 mg/kg可明显抑制腹主动脉缩窄所致LVSP、LVEDP的升高(P<0.05)和±dp/dtmax的降低(P<0.01，见表3)。

组别Dose(mg/kg)LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)Sham127.85±14.2610.28±2.594452.39±205.32-4842.97±248.29Model167.19±18.43*21.44±8.15*1082.92±199.24**-996.18±132.30**L-arg200144.55±10.2113.65±2.77#3687.01±341.91#-3041.78±289.79#ETA10155.16±19.1021.36±5.522447.08±229.46-2389.51±214.67#ETA20153.20±20.3719.42±6.293942.71±387.20##-3345.87±375.85##ETA40137.93±15.86#14.38±3.28#3988.24±196.34##-3698.71±278.28##

注：*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group。

2.3 吴茱萸总碱对腹主动脉缩窄大鼠心肌组织形态学的影响 心肌组织经HE染色，于光镜下观察显示，假手术组心肌纤维排列整齐，间质未见增生和水肿，心肌细胞核位于细胞中央，无异常发现，细胞无炎症及变性坏死(见图1A)。模型组可见心肌细胞明显增大，细胞边缘不清晰，排列紊乱，细胞核固缩，心肌细胞束间隙增宽，细胞间质见水肿和炎症细胞浸润(见图1B)。与模型组比较，吴茱萸总碱低、中剂量组的心肌纤维排列、增粗及间质水肿程度较模型组有所减轻，中剂量组相对比低剂量减轻明显(见图1D、E)。吴茱萸总碱高剂量和L-arg组的心肌纤维排列明显较模型组整齐，间质炎细胞浸润及纤维组织增生较轻，间质水肿明显减轻，心肌细胞形态基本正常，结构较完整清晰(见图1C、F)。

注：A：假手术组；B：模型组；C：L-arg组(200 mg/kg)；D：吴茱萸总碱10 mg/kg；E：吴茱萸总碱20 mg/kg；F:吴茱萸总碱40 mg/kg。 图1 吴茱萸总碱预防给药对腹主动脉缩窄大鼠左室心肌病理学的影响(HE×400)

2.4 吴茱萸总碱对腹主动脉缩窄大鼠左室心肌CaN和ANF mRNA表达的影响 Real-time PCR检测结果显示，模型组与假手术组相比，CaN和ANF mRNA的表达显著升高，分别增加1.6倍、10.3倍(P<0.01)。与模型组比较，吴茱萸总碱中、高剂量组明显下调CaN和ANF mRNA(P<0.05)的表达(见图2)。

注：**P<0.01 vs Sham group;#P<0.05,# #P<0.01 vs Model n=12)。 图2 吴茱萸总碱对腹主动脉缩窄心肌组织中CaN 和 ANFmRNA表达的影响

3 讨论

腹主动脉部分缩窄致左心肌肥厚病理模型，可使动脉血压升高，类似临床高血压所致压力负荷型心肌肥厚。持续的心肌肥厚可导致心力衰竭、严重心律失常或猝死[1]，积极寻求防治心肌肥厚的药物和方法一直是心血管研究领域的热点。吴茱萸是我国传统中药，近年来我室研究证实吴茱萸生物碱具有抑制血管平滑肌细胞增殖作用[8],吴茱萸提取物对野百合碱所致大鼠右心室肥厚产生明显的抑制效应[6]。本实验的目的是观察吴茱萸总生物碱对大鼠左室肥厚的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

报道表明[9]，大鼠腹主动脉部分缩窄致左心肌肥厚病理模型，在建立模型后3～4周达稳定高峰。本实验于建模后第2天开始预防给药，连续4周。4周后与假手术组比较，模型组LVW和LVHI明显增加，提示左心室已发生肥厚性病理变化；模型组LVSP和LVEDP的升高，提示由于心脏压力负荷的增加影响左室收缩和舒张功能；±dp/dtmax显著降低提示左室舒缩性能下降。与此同时，模型组心肌病理组织学的变化，与上述心肌组织结构及血流动力学相一致，进一步证实左室造模成功。吴茱萸总碱20 mg/kg和40 mg/kg给药4周，明显抑制大鼠腹主动脉缩窄所致LVW、LVHI、LVSP和LVEDP的升高和±dp/dtmax的降低，明显减轻腹主动脉缩窄导致的病理学损伤，表明吴茱萸总碱具有明显的防治实验性左室肥厚作用。ANF是胚胎期基因，其重新表达是心肌肥大的重要标志，吴茱萸总碱各给药组显著下调造模引起ANF mRNA的升高，进一步佐证吴茱萸总碱防治左室肥厚的作用。

CaN 是介导心肌肥大信号通路的重要蛋白磷酸酶，胞浆内Ca2+浓度升高活化CaN，进而使NFAT3去磷酸化后转位进入细胞核，NFAT3与锌指蛋白转录因子GATA4一起活化核内心肌肥大相关基因如ANF等的表达，导致心肌肥厚[10]。吴茱萸总碱抑制CaN mRNA的表达，其抑制作用随给药剂量的增加作用增强，呈一定的量效关系，提示吴茱萸总碱防治大鼠左室肥厚的作用与其抑制CaN参与的心肌肥厚信号通路有关。

[参考文献]

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[3] Hu C P, Xiao L, Deng H W, et al. The cardioprotection of Rutaecarpine is mediated byendogenous calcitonin related-gene peptide through activation of vanilloid receptors in guinea-pig hearts[J]. Planta Med,2002,68(8)：705-709.

[4] Li J Z, Peng J, Xiao L,et al. Reversal of isoprenaline-induced cardiac remodeling by rutaecarpine via stimulation of calcitonin gene-related peptide production.[J]. Can J Physiol Pharmacol，2010,88(10):949-959.

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[6] 高永双,孙安盛,何娜,等.吴茱萸提取物对大鼠右室肥大细胞外信号调节激酶- mRNA表达的抑制作用[J]. 时珍国医国药,2011,22(5):1122-1123.

[7] Grodzicki T ,Messerli F H. The heart in the hypertensive elderly[J] . J Hum Hypertens,1998,12 (9):593-597.

[8] 徐 洋，侯化化，李 强，等.吴茱萸生物碱类抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖作用的比较[J]. 时珍国医国药,2013,24(9):2079-2080.

[9] 杨 涛,张 伟, 张 雷. 大鼠腹主动脉缩窄模型的制备及其效果的探讨[J]. 中国老年学杂志, 2009, 29(1):24-26.

[10] Evans T.Regulation of cardiac gene expression by GATA-4/5/6[J].Trends Cardiovasc Med,1997, 7(3):75-83.