20味中草药对3种奶牛乳腺炎致病菌的体外抑菌试验

刘春杰等

【摘 要】本试验采用琼脂平板打孔灌药法，根据中兽医理论选择当归、川芎、金银花等20味中草药对奶牛乳腺炎3种主要致病菌进行体外抑菌试验。并测定所筛选的11味中药的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。试验结果表明，当归、川芎、蒲公英、川红花、白术、金银花6味中药对奶牛乳腺炎3种病原菌的综合抑菌效果较好，此结果为进一步研制治疗奶牛乳腺炎复方中药制剂提供实验数据。

【关键词】中草药；奶牛乳腺炎；病原菌；抑菌试验

【Abstract】This study was adopted flat hole filling method， selected the Angelica， Chuanxiong， Dandelion， Honeysuckle and other 20 kinds of herbal medicine on the cow mastitis causing 3 kinds of main pathogenic bacteria in vitro antibacterial test. Determination of minimum inhibitory concentration and the screening of 11 traditional Chinese medicines and two groups of formula （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC）. The test results show that 3 kinds of pathogenic bacteria of dairy cow mastitis can be effectly suppressed by Angelica， Chuanxiong， Dandelion， Safflower， Atractylodes， Honeysuckle. It will could be provide experimental data for the further development of the treatment of mastitis compound Chinese medicine preparation.

【Key words】Chinese herbs；Dairy cow mastitis； Pathogenic bacteria； Antibacterial test

奶牛乳腺炎是危害奶牛养殖业最常见的疾病之一，虽然对其研究已经有150多年的历史，取得了一些令人可喜的成果，但仍然是当今奶牛场难以控制的疾病，给奶牛养殖带来巨大的经济损失，包括治疗费用、牛奶废弃增加的劳动量、奶产量的下降、母牛过早淘汰、奶品质下降等。据报道引起奶牛乳腺炎的主要致病菌有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等。自抗生素在临床应用以来，人们大量应用抗生素治疗奶牛乳腺炎，使该病的防治有了巨大的突破。由于抗生素的滥用致使病原菌的抗药性增强且导致高药物残留等问题的发生[1]。中草药属于天然药物，对人类及动物无毒副作用且不易产生抗药性，药物残留相对低等优势。因此筛选对病原微生物抑菌强度大、特异性高、对环境稳定的中草药来防治奶牛乳腺炎是发展奶牛业的一项重要课题。本试验目的在于筛选对奶牛乳腺炎致病菌敏感的中草药，为中兽医临床防治乳腺炎打下基础[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，链球菌是本研究室从长春及其周边地区患乳腺炎奶牛的牛乳中分离纯化鉴定得到。

1.1.2 药物

金银花、大青叶、川红花、蒲公英、桃仁、诃子、秦皮、炮姜、益母草、当归、白芍、枳壳、红花、黄芩、黄芪、熟地、鱼腥草、地榆等均购自长春市吉林大药房。

1.1.3 主要器材

上海智诚生化培养箱、苏州净化设备有限公司超净工作台，青岛海尔4℃冰箱、德国赛多利斯电子天平、日本三洋立式高压灭菌锅、上海新苗数显式鼓风干燥箱、可调温电炉、电子恒温水浴锅、高速离心机、旋转蒸发仪、移液枪等。

1.1.4 药品与试剂

营养琼脂、营养肉汤、小牛血清的制备按有关文献进行[3]。

1.2 方法

1.2.1 中药制备

分别取20味中草药各100g，首次加水1000mL，浸泡2h后煮沸，后文火煮60min。4层纱布滤过药液。所剩滤渣加水500mL再次煎煮60 min，滤过并弃去药渣，合并2次滤过药液，经过蒸发、抽滤、烘干，浓缩至50mL，使其终浓度为1g/mL，浓缩后分别装入有塞广口瓶，用封口膜封口，贴上标签，120℃30min灭菌，-20℃冻存。正式试验时用生理盐水配成所需浓度，4℃保存待用[1， 4-5]。

1.2.2 菌种培养

试验所用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌扩增采用普通肉汤培养基进行，用2%小牛血营养肉汤培养基扩增培养链球菌。菌株接种后置于37℃培养箱中培养24h，待菌种复壮后使用。将复壮后的大肠杆菌接种到含10mL肉汤培养基的试管中，37℃恒温培养6h；金黄色葡萄球菌接种到含l0mL肉汤培养基的试管中，37℃恒温培养18h；链球菌接种到10mL血清肉汤培养基的试管中，37℃恒温培养18h。将肉汤培养扩增的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌用肉汤培养基进行1：500稀释备用。链球菌用小牛血清肉汤培养基进行l：5稀释备用[6]。

1.2.3 20种中草药体外抑菌试验

体外抑菌试验采用琼脂平板打孔灌药法进行。取稀释后的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌液各200μL，用“L”型玻璃棒均匀涂抹于普通琼脂平板上；链球菌200μL均匀涂于小牛血清琼脂板上。然后待菌液被吸收后在平板上用直径为6mm打孔器打孔4孔/板，孔间距为20mm，挖出琼脂，注入受试药液40μL/孔，每药2个重复对照孔加蒸馏水，37℃培养24h后分别测量抑菌圈直径大小，每孔测量2次，最终取两孔共4次直径测量的平均值[3]。

1.2.4 结果判定标准

抑菌圈直径Ф≥16mm为极度敏感；16mm≥Ф≥10mm为高度敏感；10mm≥Ф≥7mm小于为低敏感；7mm≥Ф为不敏感；无抑菌圈为耐药[8]。

1.2.5 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定

从体外抑菌试验中选出11味对3种致病菌高度敏感的中药采用试管法测定其MIC和MBC[4]。每种药液用10支试管。试管中注入普通营养肉汤（用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）或血清营养肉汤（用于链球菌）lmL。将lmL灭菌药液注入第l支试管，用移液枪吹打3下，混匀后吸取1ml注入第2支试管，倍比稀释，依此类推，到第9管时吸出1mL弃掉，第10管不加药液只加1mL纯培养基。随后分别在这10个试管中注入0.1mL菌液（含菌量为107/mL），吹打混和均匀。置37℃培养24h后观察混浊度。从试管外观察，透明、无混浊为此药最小抑菌浓度（MIC）。从其中吸取10μL培养物接种于小牛血清琼脂平板上，37℃培养36h计数菌落数。3个视野无菌落为无菌生长。此管中药物的浓度为此药的最小杀菌浓度。

2 结果

2.1 20味中药体外抑菌试验结果

从表1看出：川红花、金银花、白术、黄芩、茯苓、当归、川芎对3种病原菌都有不同程度的抑菌作用；熟地、大青叶、白芍、地榆仅对金葡菌和链球菌有抑菌作用；枳壳仅对金葡菌和大肠杆菌有抑菌作用，对链球菌无抑菌作用。

2.2 11味中药的MIC和MBC的测定结果

11种中药的MIC和MBC的测定结果见表2。

由表2可以看出，当归、川芎、蒲公英、川红花、白术、金银花对3种病原菌都有明显的杀灭效果。熟地、大青叶、白芍对金葡菌和链球菌有明显的杀灭效果。鱼腥草、枳壳对金葡菌和大肠杆菌有明显的杀灭效果作用。

3 讨论

从以上实验数据可知，能够抑制奶牛乳腺炎3种主要病原菌的中草药有很多，其中，当归、川芎、蒲公英、川红花、白术、金银花等有效杀灭引起奶牛乳腺炎的病原菌。说明应用中草药治疗奶牛乳腺炎有着很好的应用前景，而且为有效的中药复方制剂研究奠定基础[9]。

根据有关报道中草药能够有效抑制细菌的生长，其抗菌作用比抗生素强l000倍。但由于所使用的中草药品质相差悬殊及复合方剂进入动物体内难以达到高效的体内抑菌浓度，使中草药的治疗效果欠佳。其中也与中草药抗菌的有效活性成分在体内和体外的环境不同引起药物抗菌能力下降有关，这也与动物体内消化液、酶、激素等化学成分对其影响较大有关，从而使很大部分中药没有达到与抗生素一样的效果。另外，中药不仅具有抗菌作用，还有抗炎作用和调节体内免疫的作用，因此，在选择防治奶牛乳腺炎的中草药时，不仅要进行体外抑菌试验筛选，还要将挑选出来的中草药进行动物体内抑菌试验以确保药物的安全、有效。

【参考文献】

[1]魏彦.浅谈中药汤剂制法[J].中药研究与信息，2002，4（7）：52-3.

[2]白峰，王文魁，王广彬，等.22味中草药对3种奶牛乳腺炎病原菌的体外抑菌试验[J].畜牧兽医杂志，2009（05）：5-7.

[3]马保臣，李建基，刘翠艳.17种中药对奶牛乳腺炎4种病原菌的抑菌试验[J].中国兽医杂志，2003（07）：28-9.

[4]丁月云，李茜，王恬.21种中药对奶牛乳房炎3种病原菌的体外抑菌试验[J].畜牧与兽医，2004，（12）：5-7.

[5]王广彬，刘耀伟，白峰，等.桉叶、艾叶对奶牛乳房炎主要病原菌的体外抑菌效果[J].广西畜牧兽医，2008（05）：296-7.

[6]李亚林，段晓琴，简子健，等.中草药对奶牛临床型乳腺炎病原菌的体外抑菌试验[J].畜禽业，2008（02）：58-60.

[7]徐叔云，卞如濂，陈修.药理学实验方法学[M].2002.

[8]郁建生，周芳英.20种中草药制剂抑菌试验初报[J].中兽医学杂志，1995（1）：2-4.

[9]易湘蓉，李娜，刘毅，等.中草药防治奶牛乳腺炎的研究综述[J].上海畜牧兽医通讯，2005（04）：2-4.

[责任编辑：曹明明]

1.2.4 结果判定标准

抑菌圈直径Ф≥16mm为极度敏感；16mm≥Ф≥10mm为高度敏感；10mm≥Ф≥7mm小于为低敏感；7mm≥Ф为不敏感；无抑菌圈为耐药[8]。

1.2.5 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定

从体外抑菌试验中选出11味对3种致病菌高度敏感的中药采用试管法测定其MIC和MBC[4]。每种药液用10支试管。试管中注入普通营养肉汤（用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）或血清营养肉汤（用于链球菌）lmL。将lmL灭菌药液注入第l支试管，用移液枪吹打3下，混匀后吸取1ml注入第2支试管，倍比稀释，依此类推，到第9管时吸出1mL弃掉，第10管不加药液只加1mL纯培养基。随后分别在这10个试管中注入0.1mL菌液（含菌量为107/mL），吹打混和均匀。置37℃培养24h后观察混浊度。从试管外观察，透明、无混浊为此药最小抑菌浓度（MIC）。从其中吸取10μL培养物接种于小牛血清琼脂平板上，37℃培养36h计数菌落数。3个视野无菌落为无菌生长。此管中药物的浓度为此药的最小杀菌浓度。

2 结果

2.1 20味中药体外抑菌试验结果

从表1看出：川红花、金银花、白术、黄芩、茯苓、当归、川芎对3种病原菌都有不同程度的抑菌作用；熟地、大青叶、白芍、地榆仅对金葡菌和链球菌有抑菌作用；枳壳仅对金葡菌和大肠杆菌有抑菌作用，对链球菌无抑菌作用。

2.2 11味中药的MIC和MBC的测定结果

11种中药的MIC和MBC的测定结果见表2。

由表2可以看出，当归、川芎、蒲公英、川红花、白术、金银花对3种病原菌都有明显的杀灭效果。熟地、大青叶、白芍对金葡菌和链球菌有明显的杀灭效果。鱼腥草、枳壳对金葡菌和大肠杆菌有明显的杀灭效果作用。

3 讨论

从以上实验数据可知，能够抑制奶牛乳腺炎3种主要病原菌的中草药有很多，其中，当归、川芎、蒲公英、川红花、白术、金银花等有效杀灭引起奶牛乳腺炎的病原菌。说明应用中草药治疗奶牛乳腺炎有着很好的应用前景，而且为有效的中药复方制剂研究奠定基础[9]。

根据有关报道中草药能够有效抑制细菌的生长，其抗菌作用比抗生素强l000倍。但由于所使用的中草药品质相差悬殊及复合方剂进入动物体内难以达到高效的体内抑菌浓度，使中草药的治疗效果欠佳。其中也与中草药抗菌的有效活性成分在体内和体外的环境不同引起药物抗菌能力下降有关，这也与动物体内消化液、酶、激素等化学成分对其影响较大有关，从而使很大部分中药没有达到与抗生素一样的效果。另外，中药不仅具有抗菌作用，还有抗炎作用和调节体内免疫的作用，因此，在选择防治奶牛乳腺炎的中草药时，不仅要进行体外抑菌试验筛选，还要将挑选出来的中草药进行动物体内抑菌试验以确保药物的安全、有效。

【参考文献】

[1]魏彦.浅谈中药汤剂制法[J].中药研究与信息，2002，4（7）：52-3.

[2]白峰，王文魁，王广彬，等.22味中草药对3种奶牛乳腺炎病原菌的体外抑菌试验[J].畜牧兽医杂志，2009（05）：5-7.

[3]马保臣，李建基，刘翠艳.17种中药对奶牛乳腺炎4种病原菌的抑菌试验[J].中国兽医杂志，2003（07）：28-9.

[4]丁月云，李茜，王恬.21种中药对奶牛乳房炎3种病原菌的体外抑菌试验[J].畜牧与兽医，2004，（12）：5-7.

[5]王广彬，刘耀伟，白峰，等.桉叶、艾叶对奶牛乳房炎主要病原菌的体外抑菌效果[J].广西畜牧兽医，2008（05）：296-7.

[6]李亚林，段晓琴，简子健，等.中草药对奶牛临床型乳腺炎病原菌的体外抑菌试验[J].畜禽业，2008（02）：58-60.

[7]徐叔云，卞如濂，陈修.药理学实验方法学[M].2002.

[8]郁建生，周芳英.20种中草药制剂抑菌试验初报[J].中兽医学杂志，1995（1）：2-4.

[9]易湘蓉，李娜，刘毅，等.中草药防治奶牛乳腺炎的研究综述[J].上海畜牧兽医通讯，2005（04）：2-4.

[责任编辑：曹明明]

1.2.4 结果判定标准

抑菌圈直径Ф≥16mm为极度敏感；16mm≥Ф≥10mm为高度敏感；10mm≥Ф≥7mm小于为低敏感；7mm≥Ф为不敏感；无抑菌圈为耐药[8]。

1.2.5 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定

从体外抑菌试验中选出11味对3种致病菌高度敏感的中药采用试管法测定其MIC和MBC[4]。每种药液用10支试管。试管中注入普通营养肉汤（用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）或血清营养肉汤（用于链球菌）lmL。将lmL灭菌药液注入第l支试管，用移液枪吹打3下，混匀后吸取1ml注入第2支试管，倍比稀释，依此类推，到第9管时吸出1mL弃掉，第10管不加药液只加1mL纯培养基。随后分别在这10个试管中注入0.1mL菌液（含菌量为107/mL），吹打混和均匀。置37℃培养24h后观察混浊度。从试管外观察，透明、无混浊为此药最小抑菌浓度（MIC）。从其中吸取10μL培养物接种于小牛血清琼脂平板上，37℃培养36h计数菌落数。3个视野无菌落为无菌生长。此管中药物的浓度为此药的最小杀菌浓度。

2 结果

2.1 20味中药体外抑菌试验结果

从表1看出：川红花、金银花、白术、黄芩、茯苓、当归、川芎对3种病原菌都有不同程度的抑菌作用；熟地、大青叶、白芍、地榆仅对金葡菌和链球菌有抑菌作用；枳壳仅对金葡菌和大肠杆菌有抑菌作用，对链球菌无抑菌作用。

2.2 11味中药的MIC和MBC的测定结果

11种中药的MIC和MBC的测定结果见表2。

由表2可以看出，当归、川芎、蒲公英、川红花、白术、金银花对3种病原菌都有明显的杀灭效果。熟地、大青叶、白芍对金葡菌和链球菌有明显的杀灭效果。鱼腥草、枳壳对金葡菌和大肠杆菌有明显的杀灭效果作用。

3 讨论

从以上实验数据可知，能够抑制奶牛乳腺炎3种主要病原菌的中草药有很多，其中，当归、川芎、蒲公英、川红花、白术、金银花等有效杀灭引起奶牛乳腺炎的病原菌。说明应用中草药治疗奶牛乳腺炎有着很好的应用前景，而且为有效的中药复方制剂研究奠定基础[9]。

根据有关报道中草药能够有效抑制细菌的生长，其抗菌作用比抗生素强l000倍。但由于所使用的中草药品质相差悬殊及复合方剂进入动物体内难以达到高效的体内抑菌浓度，使中草药的治疗效果欠佳。其中也与中草药抗菌的有效活性成分在体内和体外的环境不同引起药物抗菌能力下降有关，这也与动物体内消化液、酶、激素等化学成分对其影响较大有关，从而使很大部分中药没有达到与抗生素一样的效果。另外，中药不仅具有抗菌作用，还有抗炎作用和调节体内免疫的作用，因此，在选择防治奶牛乳腺炎的中草药时，不仅要进行体外抑菌试验筛选，还要将挑选出来的中草药进行动物体内抑菌试验以确保药物的安全、有效。

【参考文献】

[1]魏彦.浅谈中药汤剂制法[J].中药研究与信息，2002，4（7）：52-3.

[2]白峰，王文魁，王广彬，等.22味中草药对3种奶牛乳腺炎病原菌的体外抑菌试验[J].畜牧兽医杂志，2009（05）：5-7.

[3]马保臣，李建基，刘翠艳.17种中药对奶牛乳腺炎4种病原菌的抑菌试验[J].中国兽医杂志，2003（07）：28-9.

[4]丁月云，李茜，王恬.21种中药对奶牛乳房炎3种病原菌的体外抑菌试验[J].畜牧与兽医，2004，（12）：5-7.

[5]王广彬，刘耀伟，白峰，等.桉叶、艾叶对奶牛乳房炎主要病原菌的体外抑菌效果[J].广西畜牧兽医，2008（05）：296-7.

[6]李亚林，段晓琴，简子健，等.中草药对奶牛临床型乳腺炎病原菌的体外抑菌试验[J].畜禽业，2008（02）：58-60.

[7]徐叔云，卞如濂，陈修.药理学实验方法学[M].2002.

[8]郁建生，周芳英.20种中草药制剂抑菌试验初报[J].中兽医学杂志，1995（1）：2-4.

[9]易湘蓉，李娜，刘毅，等.中草药防治奶牛乳腺炎的研究综述[J].上海畜牧兽医通讯，2005（04）：2-4.

[责任编辑：曹明明]