基于mtDNA ND1基因序列研究不同地理群体波纹唇鱼的遗传多样性和遗传分化

2014-08-14胡静侯新远尹绍武祝斐贾一何胡亚丽

海洋通报 2014年2期

胡静，侯新远，尹绍武，祝斐，贾一何，胡亚丽

（1.南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210023；2.海南大学海洋学院，海南海口 570228）

波纹唇鱼（Cheilinus undulatus），在分类学上隶属鲈形目（Perciformes）、隆头鱼科（Labridae）、唇鱼属（Cheilinus），是一种暖水性鱼类，同时也是体型最大的珊瑚礁鱼类之一。分布于非洲东岸、红海以及印度洋至太平洋中心，在我国主要分布于南海与东海的南部海域（沈世杰，1993；Donaldson etal，2001）。波纹唇鱼为名贵的海水经济鱼类，其肉质细嫩味鲜，营养价值高，深受亚洲人喜爱。因过度捕捞及珊瑚礁栖息地破坏等因素，导致自然海区的波纹唇鱼数量越来越少，目前已濒临灭绝。1996-2005年间波纹唇鱼曾四度被世界自然保护联盟（IUCN）、世界自然基金会（WWF）等组织和《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）列入濒危物种名单。因此，有关波纹唇鱼的遗传资源调查、资源保护等工作亟待加强。

有关波纹唇鱼繁殖研究，印度尼西亚和我国均对波纹唇鱼进行过人工诱导产卵试验，仔鱼培育均未获成功，该鱼规模化繁育难题仍然没有突破，仍旧采用的是野种家养的方式（Murdjani et al，1996；颉晓勇等，2001）。

国内有关波纹唇鱼的研究在形态学、组织学以及食用中毒及毒后救护方面有少许报道，对其同工酶、染色体核型分析以及线粒体全序列也进行了相关报道（霍蕊，2009；区又君等，2009）。

国外对波纹唇鱼的基础生物学等方面报道较多（Donaldson et al，2001；Sadovy et al，2003）。但是，目前少见关于波纹唇鱼分子遗传学方面的报道（胡静等，2012；彭艳辉等，2012），尤其是有关其种质资源和遗传多样性的研究。近年来，随着mtDNA研究的不断深入，因为其具有分子量小、结构简单、演化速度快、母系遗传等优点而成为有效的分子标记广泛应用于物种系统进化研究（郭新红等，2004；朱叶等，2012；沈玉帮等，2011；徐敬明，2010）。由于mtDNA ND1基因序列的保守性，一般很少用来作为同种生物多样性的研究，而多用在种间遗传分析水平上（Carr etal，1991；Chapman，1994），但也有少数关于ND1基因结合其他基因来研究种内和群体系统发育关系的研究报道（邵爱华等，2007；周春花等，2007）。

本研究对分布于海南陵水、马来西亚、西沙以及南沙4个不同地理群体波纹唇鱼共101尾个体的ND1基因序列进行扩增、克隆及测序，旨在研究波纹唇鱼群体的ND1基因序列变异情况，分析其序列多态性、遗传多样性以及群体的遗传关系，以获得相关数据，为该物种种群遗传多样性和保护生物学的研究提供科学资料。

1 材料和方法

1.1 样品的采集

野生群体波纹唇鱼共101尾，分别为海南陵水（LC）、马来西亚（MC）、西沙（XC）以及南沙（NC）4个不同地理群体（图1），各31、20、14、36尾，经过形态学鉴定（沈世杰，1993），对101尾个体编号，取样品尾鳍组织于95%乙醇中保存备用。

图1 波纹唇鱼的取材位置

1.2 DNA的提取、扩增、克隆及测序

分别取0.1 g尾鳍组织来提取基因组DNA。基因组DNA的提取按常规的“酚–氯仿”方法进行（萨姆布鲁克，1995），DNA经冰乙醇沉淀、70%乙醇洗涤并干燥后，用50μLTE溶解，-20℃保存备用。

从Genbank中导出波纹唇鱼的mtDNA全序列（序列号：GU296101），使用Primer primer 5.0软件设计用于扩增ND1基因的1对引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。正向引物为F1（5'CGTTAATGTGGCAGAGCT 3'），反向引物为R1（5'CTAAAAGGAGATGGAGGG 3'）。

每个PCR反应总体积均为25μL，其中包括2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL Mg2+（25 mmol/L），2μL dNTP（2 mmol/L），正反向引物各 1μL（10 μmol/L），0.3μLTaq DNA polymerase（5U/μL），14.2μL ddH2O，模板 2μL。PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后进行30个热循环（94℃、30 s，51℃、30 s，72℃、2 min），72℃延伸10min；10℃保温。

扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的条带切下并用DNA纯化试剂盒回收，目的片段与pMDTM18-TVector*1（宝生物工程有限公司）连接。连接产物与DH5ɑ感受态细胞充分混匀转化。挑取目的单克隆菌落于含有氨苄的液体培养基中扩大培养，克隆后对其菌液进行双向测序，由上海华大基因公司测序。

1.3 数据处理

双向测序结果在BLAST上进行比对分析后，人工拼接成完整序列；在ClustalX软件上对比、参照波纹唇鱼mtDNA全序列（序列号：GU296101）中对应的基因剪切测序所得序列，对比后的序列在MEGA 5.0软件（Tamura，2011）上依据 Kimura 2-parameter模型计算群体内及群体间的平均遗传距离，并构建线粒体ND1基因的单倍型NJ系统树，各分支的置信度由1 000次自举法检验；由Dnasp 5.0软件（Librado etal，2009）计算得出遗传多样性参数，如核苷酸多样性Pi以及单倍型多样性Hd等；4个群体单倍型数目、类型及分布由软件Areliquin 3.5（Excoffier，2005）生成，最后由该软件计算出碱基含量以及pairwise difference模型下的遗传分化参数并进行AMOVA分析和Tajima′s D 中性检验。

2 结果和分析

2.1 目的片段的序列特征及群体内的序列变异

对4个不同地理群体的波纹唇鱼共101尾个体的ND1基因序列进行测定，得到长度为975 bp的碱基序列。利用BLAST软件将ND1基因的101条序列与NCBI上波纹唇鱼线粒体全序列（序列号：GU296101）相应的序列进行对比，结果表明两者之间同源性很高，有的完全一致。

4个碱基A、T、G、C在101尾个体中的平均含量分别为23.79%、27.08%、15.49%和33.64%，其中各碱基含量变化范围在0.01%之间。即A+T（50.87%）＞G+C（49.13%），其中海南陵水群体（LC）的碱基含量为A 23.79%、T 27.08%、G 15.49%、C33.64% （A+T（50.87%）＞G+C（49.13%））；马来西亚群体（MC）的碱基含量为A 23.80%、T 27.08%、G 15.48%、C 33.64%（A+T（50.88%）＞G+C（49.12%））；西沙群体（XC）的碱基含量为A 23.79%、T 27.09%、G 15.48%、C 33.64% （A+T（50.88%）＞G+C（49.12%））；南沙群体（NC）的碱基含量为A 23.80%、T 27.07%、G 15.49%、C 33.64%（A+T（50.87%）＞G+C（49.13%））。A+T含量大于C+G含量，表现出较为明显的碱基组成偏倚性（见表1）。

表1 波纹唇鱼4个群体ND1基因序列的碱基含量

2.2 遗传多样性分析

由表2可知，海南陵水、马来西亚、西沙、南沙4个地理群体波纹唇鱼的多态位点数分别为7、2、2、5，单倍型数目及其多样性指数（Hd）分别为9/0.456、3/0.195、2/0.143、6/0.262，而核苷酸多样性（Pi）以及平均核苷酸差异数（K）分别为 0.000 53/0.514、0.000 21/0.200、0.000 29/0.286，0.000 29/0.278，基于单倍型多样性的比较依次为海南陵水＞南沙＞马来西亚＞西沙，而核苷酸多样性比较依次为海南陵水＞西沙=南沙＞马来西亚，平均核苷酸差异数依次为海南陵水＞西沙＞南沙＞马来西亚。数据分析表明，遗传多样性参数Hd、Pi和K之间不存在正向相关的关系，没有必然的联系。

表2 波纹唇鱼4个群体ND1基因的遗传多样性参数及Tajima′s D 中性检测

Tajima′D中性检验法被用来对不同群体波纹唇鱼受到选择作用的影响进行检测（表2）。从中性检测结果来看，4个波纹唇鱼群体（-2.071 71、-1.512 84、-1.480 74和-2.007 09）及所有个体（-1.768 09）水平上的Tajima′s D均为负值，说明波纹唇鱼经历过近期群体扩张或瓶颈效应。

2.3 遗传分化分析

由表3看出，群体内遗传距离的大小依次为海南陵水（0.000 53）＞西沙（0.000 30）＞南沙（0.000 29）＞马来西亚（0.000 21），群体间的遗传距离范围为0.000 25（马来西亚和西沙、马来西亚和南沙）～0.000 41（海南陵水和西沙、海南陵水和南沙）。波纹唇鱼的遗传分化分析中，Fst很低，甚至出现了负数，表明群体间遗传分化不明显；而海南陵水和马来西亚群体波纹唇鱼的遗传分化为0.354 26，且P﹤0.01，说明这两个群体间存在遗传分化且极显著。

表3 波纹唇鱼4个群体ND1基因群体间/群体内的K im ura 2-param eter遗传距离（左下角）及遗传分化（右上角）

AMOVA分析（表4）数据表明，-0.58%的变异来自群体间而100.58%的来自群体内。

表4 波纹唇鱼4个群体ND1基因的AMOVA分析

2.4 单倍型分析

图2 波纹唇鱼4个群体ND1基因构建的单倍型NJ系统树

表5 波纹唇鱼4个群体的ND1基因的单倍型数目类型、频率及分布

由软件MEGA5.0生成的海南陵水、马来西亚、西沙、南沙4个群体ND1基因的单倍型NJ系统树见图2，不同地理来源的单倍型均匀交错分布，无明显分支，没有体现地理差异性。由软件Areliquin 3.5生成的海南陵水、马来西亚、西沙、南沙共101尾个体的ND1基因单倍型数目、类型、频率及分布情况见表5，其中共享单倍型个数有4个，分别为Hap3、Hap5、Hap6和Hap7，比例为28.57%（4/14）。在共享单倍型中分布最广泛的是Hap3，海南陵水23尾个体、马来西亚18尾个体、西沙13尾个体以及南沙31尾个体均共用此单倍型，其比例高达84.16%（85/101），该单倍型在每个群体中出现的比例分别高达74.19%、90.00%、92.86%、86.10%。在共享单倍型中，除了Hap3，其他均为2个种群共享，另外10个单倍型均为独享单倍型。

3 讨论

3.1 目的片段序列特征

波纹唇鱼线粒体DNA ND1基因分析得出的序列碱基含量为A+T﹥G+C。线粒体DNA中A+T的含量越高，说明该物种进化地位也高，同时A+T含量的增加也增加了密码子第三位点上A与T颠换的可能性（Folmer etal，1994）。而4种核苷酸在mtDNA中呈不均一分布状态，也是动物线粒体基因组共性的特征（Brown，1985）。

3.2 遗传多样性及种群的动态

遗传多样性是存在于生物个体内、单个物种内以及物种间的基因多样性，是进化和适应性的基础，种内的遗传多样性越丰富，该物种对环境的适应能力越大。衡量遗传多样性的指数有两个重要指标：单倍型间的平均遗传距离（K）和核苷酸多样性（Pi），而Pi值考虑了各种mtDNA单倍型在群体中所占的比例，故更能精确的揭示一个群体的mtDNA的多态程度（周蕙，2006），同时是衡量群体多态程度和群体遗传分化的重要指标之一，Pi值越大表示群体多态程度越高，反之亦然。当Pi值在 0.001 5～0.004 7 范围内时（Lan etal，1993），则表明遗传多样性处于较低水平，本研究由ND1基因序列得出的波纹唇鱼整体水平的Pi值为0.000 35，说明波纹唇鱼遗传多样性低，这可能与波纹唇鱼的栖息地及人为因素有关，波纹唇鱼作为珊瑚礁栖息类鱼，其栖息地珊瑚礁正面临大面积的污染，高杀伤力渔具的捕捞也对其产生了不可恢复的损伤，甚至濒临消失。目前波纹唇鱼的野生资源有限，分布也越来越窄，这有利于个体间或群体产生基因交流，而基因交流会进一步地减少个体间的差异，使得遗传多样性降低。并且从中性检测结果来看，每个群体及所有个体水平上的Tajima′sD均为负值，此结果说明这4个海域地区的波纹唇鱼经历过近期群体扩张或瓶颈效应，由一个较小的有效种群逐渐发展而来，但还未能积累核苷酸序列的多样化（Avise，2000）。

3.3 群体的遗传结构

Fst常用来表示群体之间的分化程度。对于遗传分化指数大小和分化程度的解释，Wright提出Fst值在0.05～0.15之间表明遗传分化达中等水平（Wright，1951）。本研究中不同群体（除海南陵水和马来西亚群体）之间Fst很低，甚至出现了负数，说明群体间遗传差异很小。这可能是由于各群体还没有经过足够长的时间和完全的地理隔离来累积足够多的特有的突变，而海南陵水和马来西亚群体波纹唇鱼的遗传分化大且极显著，这可能与海南陵水这一群体地理隔离明显有关，其遗传多样性参数Hd、K、Pi均高于其他群体，且群体内遗传距离高于所有群体间遗传距离可以共同验证这一推测。从分子方差分析（AMOVA）来看，基本上全部的变异都是存在群体内，与Fst的结果一致。同时也暗示某一群体的变异水平超过了整体水平，此群体经历了高度进化，从而提供了大量变异，使得群体间的变异贡献不明显，进一步印证了上面得出的的结论：海南陵水群体存在高度进化。

从单倍型分布及频率中可看出这4个野生波纹唇鱼群体的单倍型以Hap3为主。溯祖理论（Crandalletal，1993）认为分布最广泛的单倍型为祖先类型，因此推测这4个群体波纹唇鱼单倍型共同起源于单倍型Hap3。NJ系统树表明4个波纹唇鱼群体也没有完全分开，而是不同群体的单倍型错乱交织在一起。这也提示了群体间进行了广泛的基因交流，遗传分化水平低。

本研究基于线粒体ND1基因序列变异对海南陵水、马来西亚、西沙和南沙4个不同地理群体的波纹唇鱼进行了遗传多样性和遗传分化研究，结果均显示波纹唇鱼的遗传多样性处于较低水平，遗传分化水平低。由于取材的限制，虽然不能完全反映各大海域波纹唇鱼群体遗传多样性水平和群体分化程度，也不能完全确定遗传多样性是否受到人为因素的影响，但为后续的波纹唇鱼研究积累了遗传多样性参考资料，为波纹唇鱼的种质资源保护工作提供一定的科学依据。

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