HPLC法测定黄柏青叶口服液中盐酸小檗碱的含量

许月芳，刘皈阳，马建丽，李 翔

0 引言

黄柏青叶口服液是由黄柏、大青叶、紫苏叶、白鲜皮、胖大海、甘草等6味药材组成的中药制剂，具有清热解毒、利咽消肿的作用，主要用于急性咽炎、肺胃实热证所致的咽痛、咽干、咽部灼热等症。黄柏为方中君药，是该中药制剂的主要药材之一，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的作用[1]。黄柏的主要化学成分之一是盐酸小檗碱，研究证明其具有抗菌、抗病毒等多种作用，是口服液发挥药理作用的主要有效成分之一[2]。为了更有效地评价和全面控制该制剂的质量，本试验采用高效液相色谱法测定黄柏青叶口服液中盐酸小檗碱的含量。该方法简便快速，结果准确可靠，可以为评价黄柏青叶口服液的质量提供参考和依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪(包括四元泵、VWD检测器、自动进样器、ChemStation化学工作站)；Mettler AE240电子天平(梅特勒公司)。

盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110713-200609)；十二烷基硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20090326)；药材由北京市鹤延龄中药饮片有限公司提供；黄柏青叶口服液(自制，批号：120922、121012、121025)；甲醇和乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(55:45，每100 mL加十二烷基硫酸钠0.2 g)；流速：1.0 mL/min；检测波长：345 nm；进样量：10 μL；柱温：室温。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定13.56 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成271.2 μg/mL的盐酸小檗碱对照品储备溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取本品1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例及生产工艺制备缺黄柏的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图1。结果显示，阴性对照在与对照品相同的保留时间位置，无相应的色谱峰出现，表明除黄柏外的其他药材对盐酸小檗碱的测定无干扰。

图1 高效液相色谱图

2.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品储备溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得系列对照品溶液。将系列对照品溶液依次进样，以浓度(X)对峰面积(Y)进行回归，得盐酸小檗碱的回归方程为Y=36.55 X+2.652(r=0.999 9，n=6)，结果表明，盐酸小檗碱在2.712～135.6 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.98%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(批号：12092221)，分别在0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定峰面积。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为2.17%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一样品(批号：12092221)，按“2.2.2”项下方法分别制备供试品溶液6份，各取10 μL进样测定。结果盐酸小檗碱平均含量为431.3 μg/mL，RSD为2.06%，表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取盐酸小檗碱含量为431.3 μg/mL的样品(批号：12092221)6份，精密加入271.2 μg/mL小檗碱对照品溶液0.8 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，10 μL进样，测定盐酸小檗碱的含量，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.9 样品测定 分别取3个批号的黄柏青叶口服液样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定盐酸小檗碱的含量，结果批号为120922、121012、121025的样品中，盐酸小檗碱的含量分别为431.3、422.6、442.6 μg/mL。

3 讨论

本试验尝试考察在不添加离子对试剂的流动相体系中盐酸小檗碱的分离效果，结果发现，尽管可以通过添加磷酸盐和改变pH值的办法对盐酸小檗碱进行有效分离，但其系统适应性考察结果较差[3-6]。通过在流动相体系中添加表面活性剂，采用反相离子对色谱法可以明显改善系统适应性参数，有利于盐酸小檗碱的含量测定。另外，采用对照品比对的方法，可以确认在盐酸小檗碱色谱峰前约0.5 min处的色谱峰为盐酸巴马汀，但因峰面积较低，无法进行含量测定。

通过比较水和甲醇对样品溶液制备的影响，发现不同稀释溶剂对含量测定的结果无影响，但在甲醇溶液中稀释后的样品会出现少量絮状沉淀，且更易于滤膜过滤，故选择甲醇作为样品溶液的稀释溶剂。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社,2010:286-287.

[2] 李波,朱维良,陈凯先.小檗碱及其衍生物的研究进展[J].药学学报,2008,43(8):773-787.

[3] 李翔,刘皈阳,马建丽,等.HPLC法测定扁咽口服液中盐酸小檗碱的含量[J].中国药事,2012,26(11):1235-1237.

[4] 孟艳,倪健,姜林.RP-HPLC测定土茯苓胶囊中盐酸小檗碱的含量[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(12):59-61.

[5] 叶秀金,宋粉云.HPLC测定清肺抑火丸中盐酸小檗碱的含量[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(3):90-92.

[6] 王西彬,陈畅,何希荣,等.RP-HPLC测定三黄片中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(13):128-130.