应用微卫星和下颌骨形态分析法对不同昆明小鼠种群进行遗传分析

2014-08-14韩喜彬王立辛苏玉虹巴彩凤

中国比较医学杂志 2014年4期

韩喜彬，王立辛，苏玉虹，巴彩凤

(1.辽宁医学院实验动物中心，锦州 121001； 2.辽宁医学院畜牧兽医学院，锦州 121001)

昆明(KM)小鼠中国应用广泛的封闭群实验小鼠，在科研、教学和检定实验中被大量使用，经过多年繁育不同单位的种群携带着或多或少改变的基因位点，这种变化位点的累计最终会导致具体的性状改变，使实验数据的重复性大大降低，所以急需对KM小鼠乃至所有封闭群动物建立遗传学标准，通过遗传监测使其保持遗传稳定性[1]。国内实验动物学界已经意识到昆明小鼠的遗传质量问题，较早的报道证明了不同来源的KM小鼠在体型特征、血液指标和实验反应特性等方面存在差别[2-4]；而近年以STR分析KM小鼠遗传特征的报道较多，研究结果发现不同种群之间存在中等或较大程度的遗传背景差异[5-7]。遗传控制的关键在于遗传的稳定性，即群体基因的数量和基因型频率始终保持不变，从而贮藏现存的遗传杂合性，从这一角度考量基因水平的监测必不可少，另外，动物实验是针对个体表型的测量和观察，遗传控制的结果是表型稳定，所以必须测量宏观指标。本研究选择微卫星法和下颌骨形态法对KM小鼠进行遗传分析，将遗传的内因、外因相结合，以期为封闭群动物的遗传学标准建立提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

昆明小鼠60只，(20±1)g，雌雄各半，SPF级。30只购自中国医科大学实验动物部8周龄昆明小鼠(SCXK(辽)2008-0005，简称A种群)；30只购自大连医科大学实验动物中心(SCXK(辽)2008-0002，简称B种群)。两个昆明小鼠种群都引种自北京国家啮齿类实验动物种子中心，封闭时间8年以上。实验完成于辽宁医学院实验动物中心(SYXK(辽)2008-0004)。

1.2 实验方法

1.2.1 下颌骨形态分析：下颌骨测量位点参照Festing[8]建立的方法，共利用11个变异函数，1～6为高度测量点，7～11为长度测量点，均为右侧下颌骨(支)；标本制作过程为煮沸3 min，胰酶37℃消化24 h，清水洗净，拔掉门齿，以黑色背景扫描成图像，再以Photoshop 8.0分析图像获得数据(图1)。

(1～6为高度变量，7～11为长度变量)

1.2.2 微卫星检测：常规酚氯法提取基因组DNA，参考小鼠基因组数据库 (http://www.informatics.jax.org)及本实验室之前的研究结果[9]，选取10个分布在不同染色体的微卫星位点，每个位点多态信息丰富，引物序列见表1。优化PCR反应体系，PCR产物进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，AgNO3染色，根据泳动距离进行结果判读，泳动距离最长的带设为英文字母a，依次为b、c等，泳动距离一致的为单态性(单一条带)，若有差异即为多态性(多个条带)。所用试剂均购自大连宝生物公司。平均杂合度(he)、平均多态信息含量(PIC)和遗传距离(DA)分析分别按Nei(1974)、Bosein(1980)和Nei(1983)计算(如下)。

1.2.2.1 平均杂合度、多态信息含量

式中n为特定基因位点上的等位基因数，Pi、Pj分别等于等位基因的频率，he为杂合度。

1.2.2.2 遗传距离

式中：

Xij—X群体中第j个座位上第i个等位基因的频率；

Yij—Y群体中第j个座位上第i个等位基因的频率；

表1 微卫星位点引物序列及反应条件

mj— 第j个座位上的等位基因数；

r— 检测的座位数。

1.2.3 数据处理：采用SPASS 13.0统计软件处理数据。

2 结果

2.1 下颌骨形态分析结果

下颌骨变量测量结果见表2、图2。两单位KM小鼠种群11项参数中有5个参数差别明显，B种群2项高度参数X4、X5，2项长度参数X9、X10都大于A种群，差异极显著 (P﹤0.01)，A种群只有高度参数X6大于B种群，达到差异显著(P﹤0.05)，说明两个种群小鼠的下颌骨形态存在一定差别。

表2 KM小鼠下颌骨参数测量结果

图2 KM小鼠下颌骨扫描图像

2.2 微卫星检测结果

10个微卫星位点检测结果见表3、图3。两家单位共检测出28个等位基因、31个基因型，最多等位基因数4个，最少1个，平均杂合度(he)0.472，平均多态信息含量(PIC)0.382。A种群KM小鼠共检出27个等位基因、28个基因型、平均杂合度0.525、平均多态信息含量0.402；B种群KM小鼠共检出26个等位基因、27个基因型、平均杂合度0.418、平均多态信息含量0.361。两个种群在D2NDS3等5个位点基因型分布不同，A种群的遗传多样性略高于B种群，两个种群遗传距离为0.076。

3 讨论

在KM小鼠等封闭群动物的繁育过程中，遗传污染、基因突变和选择压都能造成遗传差异，这种差异体现在异地种群间，也体现在同一种群相隔较远的代次间，遗传监测的价值在于及时、尽早地发现这些变化，在这些变化固定下来之前对种群进行调整，避免基因分布的改变。本研究以微卫星法和下颌骨分析法获得了两个单位KM小鼠的遗传学数据，两个种群的个别位点和形态参数差别明显，说明两个种群的分化是存在的，根据此结果无法说明种群合格与否，因为至今没有形成KM小鼠封闭群的定性或定量标准，检测结果只能说明其遗传特征。在国内的相关研究报道中，能够对封闭群动物的遗传学指标做出明确说明的不多，其中吴艳花等、李薇等以微卫星技术对国内遗传背景明确的几个小型猪、长爪沙鼠的种群遗传特征进行了分析，并以群体平均杂合度或平衡状态做为群体合格与否的指标[10，11]。其他以微卫星技术检测实验大鼠或小鼠遗传结构的报道并不罕见，检测结果不但能说明群体遗传概貌，也能区分一些品系[12，13]；以遗传监测为目的的下颌骨形态学检测方面的报道很少，陈哲等通过对3种白化小鼠下颌骨变量的研究，探讨了其在品系鉴别中的应用价值[14]，吴宿慧等探讨了下颌骨测量技术在性别鉴定中的作用[15]，这些研究丰富了封闭群实验动物的遗传学数据，虽然未能建立标准，也具备一定参考价值。

表3 KM小鼠10个微卫星位点检测结果

1：ab；2：aa；3：ac；4：ac；5：ac；6：ab

现今世界范围内被承认的通用标准封闭群有美国Charles River Laboratories CD-1种群(ICR小鼠和SD大鼠)以及日本CLEA的Wistar大鼠种群，两个机构基础群的建立方法相同，都取自遗传背景明确的多个种群，力求建立该品系完整基因库，再选择恰当的监测方法，在长期的繁育过程中确定具体的监测指标和操作规程，并以此方法指导选种、留种和迁移等。KM小鼠在我国分布广泛，各地种群遗传差异大，分化明显，更为重要的是遗传背景不明确，所以，目前各个单位有必要对各自种群进行连续的监测，完善基础数据，为KM小鼠遗传学监测标准的建立打下基础，让这个具有中国特色的品系稳定延续，并可促进我国实验动物标准化事业的发展。