柱花草AFLP反应体系的建立与引物筛选

韩蓉蓉等

摘 要 以柱花草奥克雷品种为材料，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，对影响AFLP反应体系的主要因素进行了优化，建立了柱花草的AFLP反应体系。结果表明：20 μL为最佳反应体系，酶切体系中DNA模板量为1 000 ng，用5 U EcoR I 37℃酶切2 h、5 U Mse I 65℃酶切2 h效果最佳；分别取5 μL酶切液、1 μL T4连接酶（5 μL/L）、1 μL EcoR I接头、1 μL Mse I接头、2 μL缓冲液（T4DNA酶自带），于22℃下连接10 min效果最佳；预扩增体系中模板稀释15倍、Mg2+浓度为0.75 mmol/L、Taq酶用量为1 U、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、引物浓度为2 ng/μL效果最佳；选择扩增体系中模板稀释20倍、Mg2+浓度为1.25 mmol/L、Taq酶为1 U、dNTPs浓度为0.225 mmol/L、引物浓度为0.4 ng/μL效果最佳。利用热研5号、奥克雷2个品种对8对引物组合进行筛选，筛选出46对引物组合，为利用AFLP标记对柱花草进行分子生物学研究及分子育种奠定基础。

关键词 柱花草 ；DNA ；AFLP ；引物筛选

分类号 S541

Establishment of AFLP Reaction System in Stylosanthes guianensias

and Its Primer Selection

HAN Rongrong1，2） ZENG Liqiong2） SHI Liangtao3）

LIU Guodao4） HE Guangxiong3） WEN Yifei1） JIN Jie3）

（1 College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201；

2 Biotechnology and Genetic Germplasm Institute / Yunnan Provincial Key Lab of Agricultural Biotechnology / Ministry of Agriculture Key Lab of Southwestern Crop Gene Resource and Germplasm Innovation，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming，Yunnan 650223；

3 Research Institute of Tropical Eco-agriculture Sciences，

Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yuanmou，Yunnan 651300；

4 Tropical Crop Genetic Resources Institute，CATAS， Danzhou，Hainan 571737）

Abstract Extract the total DNA of Stylosanthes guianensis using an improved method of CTAB. The Stylosanthes guianensis AFLP system was established and its primers were selected for analysis by optimizing the main factors affecting the AFLP system. The results indicate that the AFLP optimum conditions for restriction enzyme digestion of the Stylosanthes guianensis were as follows： 1 000 ng DNA template，5 U EcoR I at 37℃ for 2 h and 5 U Mse I at 65℃ for 2 h in 20 μL optimum reaction volume； the optimum ligation system （20 μL） was 5 μL the digestion product，1 μL T4 ligation enzyme（5 μL/L），1 μL EcoR I adapter and 1 μL Mse I adapter and 2 μLT4 Buffer reacting at 22℃ for 10 min；The preamplification reaction （20 μL） with 5μL the ligation fragment which was diluted 15 times， 0.75 mmol/L Mg2+，1 U Taq enzyme，0.2 mmol/L dNTPs，2ng/μL EcoR I and Mse I primer was the optimum condition；The selective amplification reaction （20 μL） with 5 μL preamplification product which was diluted 20 times， 1.25 mmol/L Mg2+， 1 U Taq enzyme， 0.225 mmol/L dNTP， 0.4 ng/μL EcoR I and Mse I primer was the optimum condition. Finally， 46 pairs of primers were screened out for the AFLP analysis of Stylosanthes guianensis. Lay a foundation of molecular biology research and molecular breeding of Stylosanthes guianensis by AFLP molecular marker.endprint

Keywords Stylosanthes guianensis ； DNA ； AFLP ； primer selection

AFLP（Amplified fragment length polymorphism）即扩增片段长度多态性，是由荷兰科学家Vos等[1]提出的一种检测DNA分子多态性的分子标记技术，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性。目前，该技术在植物遗传结构和遗传多样性分析[2-3]、植物分子遗传图谱的构建和重要性状基因定位[4-5]、植物亲缘关系鉴定[6-7]、分子标记辅助选择育种[8]等方面得到广泛应用。柱花草（Stylosanthes guianensis）是多年生豆科植物，是世界上热带、亚热带地区最重要的放牧和刈割兼用型豆科牧草[9]。目前，有关柱花草的研究大都集中在病害、抗性以及逆境对其生长的影响方面，而关于柱花草分子标记方面的研究较少，目前有ISSR[10]、RAPD[11-12]、SRAP[13]、微卫星标记[14]的相关报道。关于柱花草AFLP分子标记的报道，有感病与抗病柱花草遗传多样性的AFLP分析[15]，但是并没有建立最佳的APLP反应体系。本研究以奥克雷为材料，进行反应条件的优化，从而建立柱花草AFLP分析的最佳体系，同时利用热研5号、奥克雷柱花草进行引物筛选，为开展柱花草遗传多样性、图谱构建等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

云南省农业科学院热区生态农业研究所实验基地培育的热研5号、奥克雷柱花草。

1.1.2 试剂

试验使用的EcoR I酶，Mse I酶，T4 DNA连接酶，dNTPs，Taq聚合酶均购自Thermo公司；RNA酶购自Takara公司；引物接头序列（表1）由上海生工公司合成。

1.1.3 主要仪器

DNA扩增仪（Biometra Tprofessional PCR仪），电泳仪（北京六一 DYY-6C型号），凝胶成像系统（Syngene），紫外分光光度计（Beckman Coulter DU730）。

1.2 方法

1.2.1 柱花草基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法，参考孙小武等[16]的西瓜根尖快速提取DNA方法，稍作改进。

1.2.2 柱花草AFLP反应体系优化

（1）酶切连接体系 采用20 μL反应体系。酶切体系设模板浓度、酶切时间以及单酶切双酶切3个变量。其中模板浓度设为800、1 000、1 200、1 400 ng 4个梯度；酶切时间设1、1.5、2、1.5 h 4个梯度。单酶切：分别在各模板中加入EcoR I酶（10 U/μL）0.5 μL， Buffer EcoR I 2.5 μL，加ddH2O补足20 μL，充分混合后瞬离，以37 ℃温浴（时间梯度1、1.5、2、2.5 h），再以65℃对酶灭活20 min；分别取上述EcoR I单酶切液15 μL，加入Buffer R 2 μL，Mse I酶（10 U/μL）0.5 μL，充分混合后瞬离，以65℃温浴（设与EcoR I酶切相应的时间梯度）、80℃对酶灭活20 min；双酶切：分别在各模板中加入EcoR I酶（10 U/μL）0.5 μL，Mse I酶（10 U/μL）0.5 μL，Buffer Tango 2 μL，模板DNA 1 000 ng ，加ddH2O补足20 μL，充分混合后瞬离，以37℃温浴（时间梯度1、1.5、2、2.5 h）、80℃对酶灭活20 min。

取终酶切液5 μL，T4 DNA连接酶（5 μL/L）1 μL，EcoR I接头1 μL，Mse I接头1 μL，缓冲液（T4 DNA连接酶自带）2 μL，加ddH2O补足20 μL，按Thermo公司的T4 DNA连接酶说明书连接10min。

（2）预扩增体系 采用20 μL反应体系。在其他参数不变的条件下，分别对连接产物稀释倍数、Mg2+用量、Taq聚合酶用量、dNTPs用量、引物用量进行优化。连接产物分别稀释5、10、15、20、25倍，总体系Mg2+浓度梯度设为0.25、0.5、0.75、1、1.25 mmol/L，Taq聚合酶用量梯度设为0.5、1、1.5、2、2.5 U，总体系dNTPs浓度梯度设为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L，引物浓度梯度设为1、1.5、2、2.5、3 ng/μL.反应扩增条件为：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min（25个循环）；72℃ 5 min。

（3）选择扩增体系 采用20 μL反应体系。在其他参数不变的条件下，分别对连接产物稀释倍数、Mg2+用量、Taq聚合酶用量、dNTPs用量、引物用量进行优化。连接产物分别稀释10、15、20、25、30倍，总体系Mg2+浓度梯度设为0.5、0.75、1、1.25、1.5 mmol/L，Taq聚合酶用量梯度设为0.5、1、1.5、2、2.5 U，总体系dNTPs浓度梯度设为0.175、0.2、0.225、0.25、0.275 mmol/L，引物浓度梯度设为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ng/μL。反应程序为：94℃ 4 min，94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min；94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min（12个循环）；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min（23个循环）。

1.2.3 引物筛选

利用优化后的柱花草AFLP反应体系，采用热研5号、奥克雷2个品种对8对引物组合进行筛选，从中筛选出适合柱花草AFLP分析的谱带清晰且多态性好的扩增引物。

2 结果与分析endprint

2.1 柱花草基因组DNA的质量

琼脂糖凝胶电泳结果（图 1）表明，DNA片段达到2 000 bp以上，能满足AFLP分析要求。经紫外分光光度计测定可知，所提取的柱花草基因组DNA OD260=0.101，OD280=0.051，OD260/280=1.98，说明提取的DNA可以满足柱花草AFLP反应的要求。稀释DNA浓度为100 ng/μL。

2.2 柱花草AFLP反应体系优化

2.2.1 酶切连接体系优化

不同梯度用量的柱花草基因组DNA对酶切并无显著影响，从连接DNA琼脂糖凝胶电泳结果（图 2）可以看出，1 000、1 200、1 400 ng模板用量的连接DNA条带亮度一致，较800 ng模板用量要亮。选取1 000 ng柱花草DNA进行不同时间（1、1.5、2、2.5 h）酶切处理后，同样没有显著区别。由于所用缓冲液会影响EcoR I酶与Mse I酶的催化效率，2种酶用各自的缓冲液的催化效率要显著高于共用缓冲液Buffer Tango，所以采用单酶切效果较好。综上所述， 1 000 ng DNA为最佳模板用量，EcoR I酶5 U、Mse I酶5 U分别酶切2 h为宜。

连接体系为：双酶切液5 μL，加入EcoR I 接头 1 μL，Mse I接头 1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，Buffer 2 μL，ddH2O 10 μL，22℃连接10 min。

2.2.2 预扩增体系优化

对连接产物稀释倍数、Mg2+浓度、Taq聚合酶用量、dNTPs 浓度以及引物浓度进行了优化。结果显示，连接产物稀释倍数与Mg2+浓度对预扩增的影响不显著（图3、4）。当连接产物分别稀释5、10、15、20、25倍时，扩增片段大小几乎相同，因此，柱花草AFLP预扩增体系中连接产物稀释5～25倍均可，本研究认为连接产物稀释15倍较为适宜。Mg2+浓度为0.75 mmol/L时，扩增产物片段分散最好，是柱花草AFLP预扩增反应体系的最佳Mg2+浓度。

从图5可知，Taq聚合酶对预扩增影响较大。当Taq聚合酶为0.5 U时，扩增产物量较少；当酶量为1、1.5 U时，扩增产物量明显增多，当酶量继续增多时扩增产物量又有所减少。因此，确定柱花草AFLP预扩增反应体系的最佳Taq聚合酶用量为1 U。

从图6可知，dNTPs浓度对预扩增影响不明显。当dNTPs浓度为0.1、0.15、0.2、0.3 mmol/L时，扩增产物量基本相同；当dNTPs浓度为0.25 mmol/L时，产物量略有增加，可能是PCR过程中局部温度过高，PCR管内蒸发量加大导致浓度上升。综合考虑选取0.2 mmol/L为柱花草AFLP预扩增反应体系的最佳dNTPs浓度。

从图 7可知，引物浓度对预扩增的影响很大，从1 ng/μL到2 ng/μL，预扩增产物量明显增多。引物浓度为2.5 ng/μL与2 ng/μL的预扩增产物量大致相同。而当引物浓度增加到3 ng/μL时，预扩增产物量过多。因此，选取2 ng/μL为柱花草AFLP预扩增反应体系的最佳引物浓度。

2.2.3 选择扩增体系优化

从预扩增产物稀释倍数、Taq聚合酶用量、dNTPs 浓度、Mg2+浓度以及引物浓度5方面进行选择扩增体系优化。图8～10表明，预扩增产物用量、Taq聚合酶用量和dNTPs 浓度对选择扩增都没有明显影响。从图11可知，Mg2+浓度对选择扩增有较大影响。当Mg2+浓度为0.5、0.75 mmol/L时，扩增出的产物量较少，条带亮度较低；但当浓度在1、1.25、1.5 mmol/L时，扩增出的产物量逐渐增加，但是增加幅度不明显。图 12显示，引物浓度对选择扩增有较大影响。当引物浓度为0.2 ng/μL时，选择扩增产物量较少；随着引物浓度的增大，选择扩增产物逐渐增多并趋于稳定。考虑到节省样品以及对后续银染的影响，选择预扩增产物稀释20倍、1U Taq聚合酶用量、

2.2.4 柱花草AFLP反应体系选择扩增引物筛选

利用上述方法优化出的柱花草AFLP反应体系，对8对引物组合进行筛选，筛选出46对引物（表2）。其中15对引物的AFLP选择扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳结果（图13）表明，扩增产物电泳谱带清晰、分辨率高、重复性好、多态性强且2种柱花草之间有一定的差异性。因此，这些引物可用来开展柱花草的分子生物学研究。

3 讨论与结论

3.1 柱花草基因组DNA的提取

柱花草富含多酚、多糖物质。不同的发育时期其多酚、多糖的含量不同，且不同品种之间多酚、多糖含量也有所差异。唐燕琼等[10]采用优化后的CTAB柱花草DNA提取方法，得到的DNA纯度较高，一致性好，含有杂质较少。而本研究只需提取基因组DNA，不要求观察植株后期生长发育状况，故采用柱花草种子萌发的2片子叶提取DNA即可，缩短了材料的培育时间。采用改良的CTAB法提取柱花草子叶DNA，得到纯度高质量好的基因组DNA，可以满足AFLP分子标记对DNA高质量的要求。

3.2 AFLP反应体系建立

酶切反应是AFLP反应的第一步反应，也是反应的关键步骤之一，酶切充分与否直接影响体系的最终反应结果。蒋昌顺[15]所用的EcoR I酶和Mse I酶购自NewEnglandBioLabs，Inc.，反应体系为25 μL，采用了双酶切，以37℃酶切2 h，70℃ 15 min终止反应。本研究酶切反应选用的是Thermo公司提供的EcoR I酶和Mse I酶，根据说明书，EcoR I酶与Mse I酶的最适反应温度与缓冲液均不一致，所以选取分步酶切，获得的酶切条带分布均匀，可以满足后续实验分析的要求。

建立的柱花草AFLP反应的最佳体系及条件为：1 000 ng柱花草DNA模板量加0.5 μL EcoR I（10 U/μL），以37℃酶切2 h，再加0.5 μL Mse I（10 U/μL）以65℃酶切2 h；酶切液5 μL、T4连接酶（5 U/μL）1 μL、EcoR I接头1 μL、Mse I接头1 μL、缓冲液（T4 DNA连接酶自带）2 μL，用无菌双蒸水补足20 μL，在22℃下连接10 min；取稀释15倍的连接产物5 μL、Mg2+（25 mmol/L）0.6 μL、Taq酶（5 U/μL）0.2 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL、EA00（50 ng/μL）0.8 μL、MC00（50 ng/μL）0.8 μL，以无菌双蒸水补足20 μL后进行预扩增；取稀释20倍的预扩增产物5 μL、Mg2+（25 mmol/L）1 μL、Taq酶（5 U/μL）0.25 μL、dNTPs 0.45 μL、选择扩增引物（10 ng/μL）0.8 μL，用无菌双蒸水补足20 μL后进行选择扩增。endprint

3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

不同的引物组合选择扩增后，对选择扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。黄桂华等[17]在对木麻黄AFLP反应选择扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，提到每次电泳前最好重新变性。本研究中，在选择扩增完成后立即变性一次，之后不再变性也能得到效果良好的电泳图。

聚丙烯酰胺凝胶常规的银染方法操作复杂、显色时间长，而且PAGE胶的背景模糊，不易分清条带[18]。本研究参考郭大龙等[19]的染色方法并稍作改进，电泳结束后直接把带胶的长玻璃板放到白瓷盘中（白瓷盘中盛有1 L 0.1% AgNO3溶液和10 mL无水乙醇），轻轻摇动白瓷盘，染色10 min；取出长玻璃板，用蒸馏水冲洗不超过5 s，置于1 L显影液（显影液配方：1 L蒸馏水中加入NaOH 20 g、NaHCO3 0.58 g、Na2CO3 0.4 g完全溶解后加入5 ml甲醛）中，直至条带完全显色，取出玻璃板冲洗1 min。此方法省去了有刺激气味的试剂乙酸和硫代硫酸钠的使用，节省试剂用量，降低了成本；与常规染色方法相比，缩短了染色及显色时间，且得到的染色凝胶背景清晰，条带与背景区分明显，达到了准确筛选条带的目的。

参考文献

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[19] 郭大龙，张君玉，石春梅，等. 一种简便快速高效的 DNA银染方法[J]. 河南农业科学，2010（7）：74-76.endprint

3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

不同的引物组合选择扩增后，对选择扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。黄桂华等[17]在对木麻黄AFLP反应选择扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，提到每次电泳前最好重新变性。本研究中，在选择扩增完成后立即变性一次，之后不再变性也能得到效果良好的电泳图。

聚丙烯酰胺凝胶常规的银染方法操作复杂、显色时间长，而且PAGE胶的背景模糊，不易分清条带[18]。本研究参考郭大龙等[19]的染色方法并稍作改进，电泳结束后直接把带胶的长玻璃板放到白瓷盘中（白瓷盘中盛有1 L 0.1% AgNO3溶液和10 mL无水乙醇），轻轻摇动白瓷盘，染色10 min；取出长玻璃板，用蒸馏水冲洗不超过5 s，置于1 L显影液（显影液配方：1 L蒸馏水中加入NaOH 20 g、NaHCO3 0.58 g、Na2CO3 0.4 g完全溶解后加入5 ml甲醛）中，直至条带完全显色，取出玻璃板冲洗1 min。此方法省去了有刺激气味的试剂乙酸和硫代硫酸钠的使用，节省试剂用量，降低了成本；与常规染色方法相比，缩短了染色及显色时间，且得到的染色凝胶背景清晰，条带与背景区分明显，达到了准确筛选条带的目的。

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[19] 郭大龙，张君玉，石春梅，等. 一种简便快速高效的 DNA银染方法[J]. 河南农业科学，2010（7）：74-76.endprint

3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

不同的引物组合选择扩增后，对选择扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。黄桂华等[17]在对木麻黄AFLP反应选择扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，提到每次电泳前最好重新变性。本研究中，在选择扩增完成后立即变性一次，之后不再变性也能得到效果良好的电泳图。

聚丙烯酰胺凝胶常规的银染方法操作复杂、显色时间长，而且PAGE胶的背景模糊，不易分清条带[18]。本研究参考郭大龙等[19]的染色方法并稍作改进，电泳结束后直接把带胶的长玻璃板放到白瓷盘中（白瓷盘中盛有1 L 0.1% AgNO3溶液和10 mL无水乙醇），轻轻摇动白瓷盘，染色10 min；取出长玻璃板，用蒸馏水冲洗不超过5 s，置于1 L显影液（显影液配方：1 L蒸馏水中加入NaOH 20 g、NaHCO3 0.58 g、Na2CO3 0.4 g完全溶解后加入5 ml甲醛）中，直至条带完全显色，取出玻璃板冲洗1 min。此方法省去了有刺激气味的试剂乙酸和硫代硫酸钠的使用，节省试剂用量，降低了成本；与常规染色方法相比，缩短了染色及显色时间，且得到的染色凝胶背景清晰，条带与背景区分明显，达到了准确筛选条带的目的。

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