角喙栓蚤蝇减数分裂行为观察

李翠军 冯典兴 刘广纯

摘要：以精巢和卵巢组织为材料，采用空气干燥制片法，吉姆萨和硝酸银分别染色，对角喙栓蚤蝇（Dohrniphora cornuta）减数分裂染色体形态行为进行研究。结果表明：角喙栓蚤蝇染色体的二倍體数目为2n=8，最小的一对染色体着色较深，推测为性染色体，性染色体不存在异型现象。粗线期同源染色体完成配对缠绕在一起，2条性染色体提前完成解螺旋；双线期分开的同源染色体呈现许多交叉，这些交叉联结是粗线期非姐妹染色体间发生交换的结果；后期性染色体呈短棒状先抵达两侧，证实其为端着丝粒染色体，较常染色体移动速度快。该种减数分裂过程中未发现B染色体存在。

关键词：角喙栓蚤蝇；精巢；卵巢；减数分裂；硝酸银；吉姆萨；染色体

中图分类号： Q952.6文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0125-04

收稿日期：2014-02-17

基金项目：国家自然科学基金（编号：31071965，81102296）。

作者简介：李翠军（1986—），女，辽宁朝阳人，硕士，从事细胞遗传学研究。E-mail：licuijun816@163.com。

通信作者：刘广纯，教授，从事蚤蝇学研究。E-mail：liugc01@163.com。蚤蝇是双翅目中较大科之一，是农、林、医等领域主要害虫，有些类群在生物防治和法医鉴定领域发挥重要作用[1]。对蚤蝇染色体结构数量变异、分裂行为和特殊染色体进行研究，揭示其种类演替、进化和种内进化的客观规律，可为分类系统建立、近缘种区分乃至种下分类问题提供新的方法和技术。目前，已知核型的蚤蝇共6种，分别为蛆症异蚤蝇（Megaselia scalaris）[2-4]、东亚异蚤蝇（Megaselia spiracularis）[5]、广东栅蚤蝇（Diplonevra peregrina）[6]、Pseudacteon curvatus、Pseudacteon nocens和Pseudacteon tricuspis[7]。其中，广东栅蚤蝇二倍体染色体数目2n=8，性染色体雌雄异型，另外5种蚤蝇的二倍体染色体数目均为2n=6，不存在明显的性染色体异型现象。同型染色体种类的性别可能由雄性因子M决定[8-9]，或由环境刺激决定[10]。本试验以角喙栓蚤蝇（Dohrniphora cornuta）为试材，对其染色体减数分裂各时期行为特征进行研究，旨在为蚤蝇科系统进化、遗传防治和分子遗传学奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

角喙栓蚤蝇由沈阳大学城市有害生物治理与生态安全辽宁省重点实验室饲养。

1.2方法

1.2.1染色体标本制作参照冯典兴等的空气干燥法[2]。在Ringers液中解剖出蛹期的性腺，移至固定液（甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1）中固定15～20 min，然后置于滴有少许60%冰醋酸的载玻片上解离10 min左右，用解剖针将材料充分搅碎，滴1滴固定液将细胞打散，放于50 ℃的电热板上使液体迅速蒸干，染色体充分展开固定在玻片上。

1.2.2染色体标本染色将上述处理的玻片标本用 1/10吉姆萨染液（pH值6.8）扣染至少30 min，用蒸馏水冲净玻片表面的染液，置于室温下无尘处自然干燥。

1.2.3染色体快速银染参照Howell等的方法[11]。在 60 ℃ 水浴锅中避光染色，玻片标本细胞面向上放于有湿滤纸的容器中。在玻片标本有细胞的位置，按2 ∶1的比例滴加50%硝酸银和明胶显影液，避光染色5 min左右（玻片呈金黄色为止）。取出立即用温蒸馏水漂洗染液，小心不要划掉玻片上的染色体，置于室温下无尘处自然晾干。

1.2.4染色体的观察拍照将干燥好的染色体玻片在 Olympus 相差光学显微镜下观察分析，选取分散良好的分裂相拍照。

2结果与分析

精巢形成初期在解剖镜下显示为透明的圆点状，此时制片得到的结果中混杂的有丝分裂相较多。当精巢发育呈椭球形时，有丝分裂相较少，甚至全是精子。因此，选择精巢从小圆点发育到近椭球形的时期（23 ℃环境下7～8 d），可以较容易得到减数分裂各个时期。同样情况下雌蛹卵巢制片也可以得到较多的分裂相，但减数第二次分裂过程较难观察到，得到的分裂相中大部分为减数第一次分裂，还有部分有丝分裂相。

银染技术可以使核仁形成区（NORs）呈特异性着色，还可以用于着丝粒、中心粒、减数分裂联会复合体、性泡和染色体轴的研究。本试验中4对染色体全部着色但没有明显的分带现象，与基本的吉姆萨染色结果相似，遂选精巢染色体减数分裂硝酸银染色和卵巢染色体减数分裂吉姆萨染色统一描述。

细线期：一团染色体细线散于核仁附近（图1-a、图2-a），每根细丝是由复制后的2条姐妹色单体组成。细线期完成后各同源染色体联会。

偶线期：染色体线状缩短变粗（图1-b、图2-b）。核仁没有明显的形态变化，同源染色体联会，联会复合体开始形成，每条线状染色体实际上包含了4条染色体单体，又称四合体或四联体。此时仍不能分清性染色体和染色体的条数。

粗线期：同源染色体已经完全配对，常染色体的同源染色体互相紧靠缠绕在一起，呈现3个中间有拐点的长棒状染色体对和2个短棒状性染色体。染色体着丝粒位置较集中，染色体臂自着丝粒处向外摆出，2条性染色体独立存在于着丝粒附近（图1-c、图2-c，箭头所示）。

双线期：二价体中同源染色体分开，8条染色体中3对常染色体的同源染色体着丝粒处依然紧靠，染色体臂呈现许多交叉（图1-d、图2-d，箭头所示）。染色体交叉联结在一起的现象，是粗线期非姐妹染色体间发生交换的结果。

终变期：染色体长度、粗细接近中期I染色体，交叉减少，可清晰看到3对常染色体和1对性染色体（图1-e、图2-e）。

中期Ⅰ：染色体聚缩程度最大，常染色体边缘变光滑，此时依稀可见复制后的姐妹染色单体，16条姐妹染色单体两两紧靠在一起，呈现8条状，染色体整齐排列（图1-f、图2-f），箭头示深染的性染色体。染色體形态与有丝分裂中期相似。

后期Ⅰ：同源染色体分向两侧，姐妹染色体单体不再紧靠，常染色体自着丝粒起四臂分开，性染色体呈“八”字形，此时染色体条数最清晰（图1-g、图2-g），性染色体移动较快先抵达两侧。

末期Ⅰ：达到两侧的染色体聚集成堆（图1-h、图2-h）。仔细观察，有的细胞状结构中能见到没有解聚的染色体轮廓，推测为减Ⅱ间期。

前期Ⅱ：能看到与减Ⅰ粗线期分裂行为相近的染色体，但是此时没有细胞核结构，只见3条长线状染色体和聚成一团的性染色体（图1-i），线状染色体由结合在一起的姐妹染色单体组成，性染色体聚在一起，不像减Ⅰ粗线期可分清染色体条数。

中期Ⅱ：染色体缩短压缩到最大程度，4对姐妹染色单体排成一排（侧面观），主溢痕明显断裂突出着丝粒端（图1-j，箭头所示）。

后期Ⅱ：姐妹染色体渐渐分开，性染色体较常染色体移动得快，先达到两侧（如1-k、图2-i）。

末期Ⅱ：末期持续时间较短，卵巢中未能观察到，只见圆形深染的卵细胞。精巢染色体末期并行达到两端，聚集成簇，轮廓渐近纺锤形（图1-l），准备形成精细胞。

3讨论

角喙栓蚤蝇染色体银染后，4对染色体全部着色，但没有明显的分带现象。可能的原因是染色体所处时期不利于染色或染色体活泼转录区域活性低；或是核仁形成区较小，难以辨别；再有就是标本制备时表面张力过大，致使银染物质消失。

减数第一次分裂中期与有丝分裂中期染色体形态没有明显差别，这与有丝分裂过程存在体细胞配对现象有关；但在减数第一次分裂后期染色体排列较紧密，同源染色体间紧密程度高于有丝分裂后期。

减数分裂一些重要过程主要发生在第一次分裂中，特别是前期Ⅰ。前期Ⅰ的5个时期持续时间不同，持续时间长的容易见到，持续时间短的就很难观察到，而且各期持续时间的长短随种类的不同而不一样。这一现象在卡内里虱蝇[12]、淡色库蚊[13]和广东栅蚤蝇[14]减数分裂中均有报道。角喙栓蚤蝇前期Ⅰ的偶线期、粗线期、双线期较常见，细线期和终变期次之。减数第二次分裂过程持续时间短，很难观察到，已有蚤蝇减数分裂研究中，仅蛆症异蚤蝇减数第二次的后期有过报道。本试验首次对蚤蝇减数第二次分裂过程进行了较完整观察。

粗线期和后期是观察染色体的最佳时期。在粗线期，可见3条细长的二价体和1对短小的染色体；减数第二次分裂后期，每侧可见3条“V”形染色体和1条短棒状染色体。从而证明角喙栓蚤蝇染色体数2n=8，由3对中着丝粒染色体和1对端着丝粒染色体组成。对角喙栓蚤蝇染色体进行硝酸银染色显示，最短的1对染色体着色较深、致密，并且这对染色体分裂行为有别于其他染色体，在粗线期，这对染色体较其他染色体提前分开；在后期Ⅱ，也较其他染色体移动得快，推测其为性染色体。本试验未能观察到雌雄个体性染色体间差别，2条性染色体间差别需通过RAPD、荧光原位杂交等技术近一步研究。在核型已知的蚤蝇中，除了广东栅蚤蝇性染色体异型外，其他蚤蝇性染色体均不易区分，可能这种性染色体同型现象在蚤蝇科中较普遍。

Wolf等相继报道M. scalaris和M. spiracularis中除3对染色体之外，还存在类着丝粒元件，即B染色体[5，16-18]，形态类似于着丝粒，不具染色体臂。B染色体的数目在不同物种

间和同一个体不同细胞间以及减数分裂和有丝分裂的各个时期都有所不同，导致它们行为的复杂性。在有丝分裂和减数分裂期间，大多数B染色体是稳定的，并且高度异染色质化，通常不与任何A染色体配对，在细胞中随机分布，数目变化较大。在减数分裂时B染色体不分离，具有一定的积累和消减机制。通过对角喙栓蚤蝇减数分裂观察，在4对染色体无论联会还是染色体分离都正常未受干扰，未发现B染色体存在。

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