红凤菜总黄酮的富集方法

2014-08-12任冰如陈剑吕寒等

江苏农业科学 2014年6期

任冰如+陈剑+吕寒+等

摘要：探讨从红凤菜新鲜茎叶中富集总黄酮的方法，以槲皮素为对照品，用比色法测定样品中的总黄酮含量；以红凤菜新鲜茎叶为原料，比较用不同浓度乙醇提取总黄酮的效果；以乙醇粗提物为试验样品，比较不同吸附材料在静态和动态情况下对总黄酮的吸附和解吸附性能。结果得到总黄酮含量的标准曲线为：y=2.215 7x-0.2511，r=0.999 1（n=3），其中x为吸光度，y为槲皮素的质量（mg）；结果还表明，用95%乙醇提取总黄酮的效果最佳，用大孔树脂NKA分离总黄酮的效果最好，此外D-101、HPD-100、X-5也有较好的分离效果。综合研究结果认为，用95%乙醇作提取溶剂、用NKA大孔树脂吸附层析，可有效地富集红凤菜新鲜茎叶中的总黄酮。

关键词：红凤菜；总黄酮；提取；分离

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0260-03

收稿日期：2013-09-23

项目来源：江苏省产学研联合创新资金（编号：BY2012213）；江苏省科技基础设施建设计划-科技公共服务平台项目（编号：BM2011117）。

作者简介：任冰如（1964—），女，江苏宜兴人，博士，研究员，主要从事植物资源的研究与开发工作。Tel：（025）84347081；E-mail：renbingru@263.net。

通信作者：李维林，博士，研究员，研究方向为植物学。E-mail：lwlcnbg@mail.cnbg.net。红凤菜（Gynura bicolor）为菊科菊三七属植物，别称血皮菜、观音菜、观音苋、紫背天葵等，可以作为蔬菜食用，近年来在江苏等多个地区都有栽培和销售。红凤菜全草可入药，味甘、辛，性凉，具有凉血止血、清热消肿的功效[1]。有研究显示，红凤菜含有黄酮类物质[2-4]，黄酮类物质具有保护心血管、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗病毒等活性[5]，因此从红凤菜中提取黄酮类物质具有重要意义。本试验以红凤菜的新鲜茎叶为原料，探讨用不同浓度乙醇提取总黄酮的效果，并在此基础上选用不同吸附材料对红凤菜粗提物中的总黄酮进行吸附与解吸附试验，以期筛选分离效果优良的吸附材料，有效地富集总黄酮。

1材料与方法

1.1试验仪器

Mettler AE-240十万分之一电子天平；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；BM252C电动搅拌机，广东美的精品电器制造有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HY-4A数显调速多用振荡器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2试验材料

红凤菜于2003年7月引自中国重庆，凭证标本号0648614，凭证标本保存于江苏省中国科学院植物研究所标本馆（NAS）。红凤菜的新鲜茎叶采自江苏省中国科学院植物研究所的试验苗圃中。

NKA大孔树脂，购自南开大学化工厂；AB-8大孔树脂，购自天津南开和成科技有限公司；HPD-100、X-5大孔树脂，购自河北沧州宝恩化工有限公司；D101大孔树脂，购自天津海光化工有限公司；100-200目聚酰胺粉末，购自浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂。

1.3试验试剂

槲皮素对照品购自中国食品药品检定研究院，批号：100081-200907，ID：A34P-2DV6。所用试剂均为分析纯。

1.4试验方法

1.4.1总黄酮含量的标准曲线制作及样品总黄酮含量的测定精确称取12.1 mg槲皮素对照品，用80%乙醇定容至 50 mL，即配成浓度为0.242 g/L的溶液。分别精确吸取0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL槲皮素对照品溶液至7支试管中，每个浓度重复3次；分别加入0.3 mL 5% NaNO2，摇匀；6 min后分别加入0.3 mL 10% Al（NO3）3，摇匀后放置6 min；加入4.0 mL 4% NaOH并加水定容至10 mL，放置10～15 min；在510 nm处测定吸光度值（D510 nm）。以加入的槲皮素含量（mg）为纵坐标，测得的D510 nm为横坐标，计算线性相关方程，作为测定总黄酮含量的标准曲线。吸取一定体积的待测样品代替槲皮素对照品，以相同的方法测定D510 nm，根据标准曲线计算样品中的总黄酮含量。

1.4.2不同浓度乙醇提取红凤菜总黄酮的试验称取4份20 g红凤菜鲜叶，分别加入100 mL体积分数为0、50%、70%、95%的乙醇水溶液，电动搅拌机匀浆后用超声波提取1 h（设定温度为50 ℃，功率为90%），过滤后精确吸取3 mL滤液，按“1.4.1”中的方法测定总黄酮含量，每个样品重复2次。分别取3 mL不同浓度的乙醇提取液并用70%乙醇定容到10 mL，作为不同提取液的空白对照。

1.4.3不同层析材料对红凤菜总黄酮的吸附分离特性试验

1.4.3.1红凤菜总黄酮提取液的制备称取1 000 g新鲜红凤菜茎叶，加入4 000 mL 95%乙醇，超声波提取后过滤，将滤渣重复提取1次，合并滤液并浓缩至500 mL，置于冰箱中沉淀去杂；过滤后取滤液，减压浓缩以去除残余乙醇，定容至250 mL，得红凤菜总黄酮粗提液。

1.4.3.2不同层析材料的静态吸附筛选试验分别称取 1.00 g 处理过的NKA大孔树脂、HPD-100大孔树脂、D101大孔树脂、X-5大孔树脂、AB-8大孔树脂和100～200目聚酰胺粉末，装入三角瓶中后分别加入20.0 mL红凤菜总黄酮粗提液，振荡4 h以使总黄酮充分被吸附，过滤即得20.0 mL吸附液。取上述饱和吸附后的层析材料，分别加入15.0 mL 80%乙醇，振荡4 h使总黄酮充分解吸附，过滤即得 15.0 mL 解吸附液。吸取0.1 mL各吸附液、解吸附液，按“1.4.1”中的方法测定总黄酮含量，按照下列公式计算不同层析材料在室温下的吸附量、吸附率、解吸附量及解吸附率。endprint

吸附量（mg/g）=（原液总黄酮含量×原液体积-吸附液总黄酮含量×吸附液体积）/树脂质量；

吸附率=[（原液总黄酮含量-吸附液总黄酮含量）/原液总黄酮含量]× 100%；

解吸附量（mg/g）=（解吸液总黄酮含量×解吸液体积）/树脂质量；

解吸率= 解吸附量/吸附量×100%。

1.4.3.3不同层析材料的动态吸附筛选试验分别称取 3.00 g 处理过的NKA大孔树脂、HPD-100大孔树脂、D101大孔树脂、X-5大孔树脂、AB-8大孔树脂和100～200目聚酰胺粉末，按湿法装柱，得床体积5 mL；用10倍床体积的纯净水洗涤，吸取10.0 mL红凤菜总黄酮提取液上柱，收集流出液，得10.0 mL过柱流出液；各柱加水10 mL洗脱，收集流出液，得10 mL水洗脱液；再加入15 mL 80%乙醇洗脱并收集流出液，得15 mL解吸附液。用上述方法测定各溶液中的总黄酮含量。按以下公式计算不同层析材料的上柱量、吸附量、解吸附量和解吸附率。

上柱量（mg/g）=（原液总黄酮含量×原液体积-过柱流出液总黄酮含量×过柱流出液体积）/树脂质量；

吸附量（mg/g）=（原液总黄酮含量×原液体积-过柱流出液总黄酮含量×过柱流出液体积-水洗脱液总黄酮含量×水洗脱液体积）/树脂质量；

解吸附量（mg/g）=（解吸液总黄酮含量×解吸液体积）/树脂质量；

解吸附率=解吸附量/吸附量×100%。

2结果与分析

2.1总黄酮含量的标准曲线

以槲皮素为对照品，用比色法测得的总黄酮含量的标准曲线，其中x为吸光值，y为槲皮素的质量（mg），回归方程为：y=2.215 7x-0.251 1，r=0.999 1（n=3）。可以看出槲皮素在0.242 ～0.968 mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2不同浓度乙醇提取红凤菜总黄酮的试验

水提液中的总黄酮含量最低，随着乙醇浓度的增加，提取液中的总黄酮含量明显增加，以95%乙醇的提取效果最好。

不同乙醇浓度对红凤菜新鲜茎叶中总黄酮的提取效果

样品编号乙醇浓度

（%）提取液的总黄酮含量（mg/mL）重复1重复2平均值100.0040.0050.0052500.2080.2260.2173700.8340.7580.7964950.8850.9110.898

2.3不同层析材料对红凤菜总黄酮的吸附分离特性试验

2.3.1不同层析材料的静态吸附筛选试验各种层析材料对红凤菜总黄酮的静态吸附效果。

不同层析材料的对红凤菜总黄酮的静态吸附效果

层析材料类型结构

特性吸附量

（mg/g）吸附率

（%）解吸附量

（mg/g）解吸附率

（%）NKA大孔树脂非极性12040.96150.6HPD-100大孔树脂非极性14549.57652.1D-101大孔树脂非极性15051.17751.5X-5大孔树脂非极性12542.77056.2AB-8大孔树脂弱极性12943.96550.8聚酰胺极性12743.46147.9

可以看出，5种大孔树脂对红凤菜粗提物中总黄酮的静态吸附效果有差异，其中D-101、HPD-100大孔树脂的吸附量、吸附率、解吸附量均较高，解吸附率与AB-8、NKA大孔树脂相近但低于X-5大孔树脂。

极性吸附材料聚酰胺的吸附量、吸附率和解吸附量均低于D-101、HPD-100大孔树脂，与NKA、X-5、AB-8大孔树脂相当，解吸附率则低于所有选用的大孔树脂。

因此可见，在所测定的6种层析材料中，D-101、HPD-100大孔树脂有较好的静态吸附性能，但解吸附率并不突出；X-5大孔树脂的静态吸附效果一般，但解吸附率最高；聚酰胺的静态吸附性能一般，解吸附性能最低。

2.3.2不同层析材料的动态吸附筛选试验表3是各种层析材料对红凤菜总黄酮的动态吸附效果，可以看出其吸附情况与静态吸附有较大差异。

不同层析材料的对红凤菜总黄酮的动态吸附效果

层析材料类型结构特性上柱量

（mg/g）吸附量

（mg/g）解吸附量

（mg/g）解吸附率

（%）NKA大孔树脂非极性33272280.5D-101大孔树脂非极性31252081.2HPD-100大孔树脂非极性31252184.3X-5大孔树脂非极性30241979.4AB-8大孔树脂弱极性27211675.0聚酰胺极性3322943.4

由结果可以看出，与5种大孔树脂相比，极性较高的吸附材料聚酰胺的上柱量较高，达33 mg/g；但吸附量低于NKA、HPD-100、D-101和 X-5大孔树脂，略高于AB-8大孔树脂；而其解吸附量与解吸附率则大大低于所选用的5种大孔吸附树脂。可见对于红凤菜总黄酮来说，聚酰胺的吸附性能尚可，但解吸附能力较差，不宜用于红凤菜粗提物中总黄酮的分离。

还可以看出，在所选用的5种大孔吸附树脂中，弱极性的AB-8大孔树脂对红凤菜粗提物中总黄酮的上柱量、吸附量、解吸附量和解吸附率均低于其他4种非极性大孔树脂；而非极性的NKA大孔树脂的上柱量、吸附量、解吸附量均最高，解吸附率低于HPD-100大孔树脂，与D-101、X-5大孔树脂相当。

综合考虑以上动态吸附的指标，NKA大孔树脂是分离红凤菜粗提物中总黄酮的优选吸附材料，其他3种非极性大孔树脂即D-101、HPD-100、X-5大孔树脂也有较好的分离效果。

3讨论

研究结果显示，红凤菜中的黄酮类化合物主要是槲皮素、山柰酚及其苷类物质[2-4]，因此可以采用乙醇-水混合溶剂进行提取。裴咏萍等以干燥的红凤菜叶片为原料，研究了红凤菜总黄酮的提取工艺，结果表明乙醇浓度对总黄酮的提取有显著影响，以70%乙醇提取效果最好[6]。由于红凤菜新鲜茎叶含水量高于90%[7]并且茎秆呈肉质状而难以干燥，为了节省劳力、降低能耗，本试验直接采用新鲜茎叶为原料进行提取。通过比较不同浓度乙醇的提取效果显示，95%乙醇对红凤菜新鲜茎叶的总黄酮提取效果最佳。endprint

一般认为，大孔吸附树脂的吸附是依靠树脂与化合物之间的范德华引力或形成的氢键，聚酰胺的吸附作用是依靠其分子中的酰胺羰基与黄酮类化合物的酚羟基形成的氢键[5]，大孔树脂和聚酰胺均被广泛应用于黄酮类化合物的分离和富集。本次试验结果显示，被极性吸附材料聚酰胺所吸附的总黄酮的解吸附性远远低于非极性或弱极性的大孔树脂，其原因可能是聚酰胺与黄酮分子间形成了较稳定的氢键，导致难以解吸附。

虽然在静态吸附试验中大孔树脂D-101、HPD-100表现出了较好的吸附性能，但在动态吸附试验中其吸附性能均低于NKA，说明大孔树脂D-101、HPD-100吸附的总黄酮容易被水洗脱，而NKA能较牢固地吸附总黄酮。在动态吸附试验中，NKA大孔树脂既有较好的吸附性能又有较好的解吸附性能。为了有效地分离红凤菜粗提物中的总黄酮，并综合考虑各种材料的吸附效果，应优先选用NKA大孔树脂进行动态柱层析；同时试验表明，非极性的D-101、HPD-100、X-5大孔树脂也有较好的分离效果。

参考文献：

[1]钟琼芯. 海南岛菊三七属药用植物资源调查[J]. 海南师范学院学报：自然科学版，2001，14（2）：42-44.

[2]卓敏，吕寒，任冰如，等. 红凤菜化学成分研究[J]. 中草药，2008，39（1）：30-32.

[3]吕寒，裴咏萍，李维林. 红凤菜黄酮类化学成分的研究[J]. 中国现代应用药学，2010，27（7）：613-614.

[4]吕寒，裴咏萍，李维林，等. 红凤菜中黄酮类化合物的高效液相色谱与多级质谱联用分析[J]. 时珍国医国药，2011，22（11）：2582-2583.

[5]吴立军. 天然药物化学[M]. 4版.北京：人民卫生出版社，2003：173-216.

[6]裴咏萍，李维林，吕寒. 红凤菜总黄酮提取工艺的研究[J]. 江苏农业科学，2009（2）：235-236.

[7]汪泓江，梁呈元，卓敏，等. Gynura属3个野生蔬菜营养成分的比较及评价[J]. 中国野生植物资源，2004，23（5）：48-49.魏丕伟，熊俐，王凌云，等. 超声-微波辅助提取枳椇多糖的研究[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：263-266.endprint

参考文献：

[1]钟琼芯. 海南岛菊三七属药用植物资源调查[J]. 海南师范学院学报：自然科学版，2001，14（2）：42-44.

[2]卓敏，吕寒，任冰如，等. 红凤菜化学成分研究[J]. 中草药，2008，39（1）：30-32.

[3]吕寒，裴咏萍，李维林. 红凤菜黄酮类化学成分的研究[J]. 中国现代应用药学，2010，27（7）：613-614.