8株白僵菌菌株的抗逆性研究

2014-08-12滕忠才刘廷辉张立红董建臻李瑞军

江苏农业科学 2014年6期

关键词：白僵菌小菜蛾抗逆性

滕忠才+刘廷辉+张立红+董建臻+李瑞军+李保国

摘要：对8个白僵菌（Beauveria bassiana）菌株的抗旱力、耐高温能力、抗紫外线能力和耐低温能力等生物学性状进行了测定，综合各菌株的生物学特性和对小菜蛾幼虫的毒力指标，最终得出优良菌株是BD-B026。

关键词：小菜蛾；白僵菌；抗逆性；抗旱力；耐高温能力；抗紫外线能力；耐低温能力

中图分类号： S482.3+9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0122-03

收稿日期：2013-12-29

基金项目：河北省科技支撑计划（编号：12220302D）；河北省现代农业产业技术体系小麦创新团队项目。

作者简介：滕忠才（1970—），男，河北献县人，硕士，讲师，主要从事农业昆虫与害虫综合防治研究。E-mail：teng-zhongcai@163.com。

通信作者：李瑞军（1967—），男，河北昌黎人，博士，副教授，主要从事害虫生物防治及农业生态安全研究。Tel：（0312）7528172；E-mail：liruijun99@sina.com。白僵菌作为一种重要的杀虫真菌，在国外已被开发成为多种剂型并登记注册[1-3]。随着近十多年来丝孢类生防真菌制剂技术的不断发展，长期困扰菌剂本身的生产、加工及应用的很多技术难题都被有效解决[3-5]，使得越来越多的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）制剂用于农林害虫的防治[4]。虽然能够寄生多种昆虫，但不同菌株对寄主有一定的专化性，致病力也有一定的差异[5]，其致病力主要取决于菌株、害虫虫态以及环境条件等因素[6]。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是白僵菌属中的一种，主要发生于包括鞘翅目和半翅目等绝大多数昆虫[7]，其有效成分是具有细胞生命特征的侵染体（分生孢子或菌丝体）。白僵菌菌株抗逆性的强弱在很大程度上决定着菌剂本身的生态适应性和田间应用效果。即使同一菌株在不同的寄主上也表现出不同的毒力，不同菌种或同一菌种的不同菌株在抗逆性方面往往存在较大的差异[8]，因而，筛选高毒力且抗逆性强的菌种菌株是提高生防菌剂技术含量和适用性的重要途径之一。

1材料与方法

1.1材料

供试菌株：对小菜蛾高毒力的白僵菌菌株BD-B007、BD-B008、BD-B001、BD-B021、BD-B010、BD-B029、BD-B017、 BD-B026，均为笔者所在实验室自主分离。供试试虫：笔者所在实验室人工饲养的小菜蛾2～3龄幼虫。培养基：SDAY固体培养基（葡萄糖4%，蛋白陈1%，酵母粉1%，琼脂2%）；SDAY液体培养基（葡萄糖4%，蛋白陈1%，酵母粉1%）。营养液：2%的葡萄糖和5%的蛋白胨。

1.2高毒力白僵菌菌株抗旱力的筛选

1.2.1高毒力白僵菌菌株抗旱力的测定取芽生孢子悬液，以SDAY液体培养基为基础培养基，加入10%的PEG200（聚乙二醇，分子量6 000），在（25±1） ℃下培养，测其萌发中时GT50′；以未加PEG200的菌液为对照，测定其萌发中时GT50。以GT50′与GT50之差作为孢子耐干旱能力的大小，每次测定各菌株设3个重复（萌发液试管3支）。

1.2.2干旱胁迫下高毒力白僵菌菌株生长量的测定取芽生孢子悬液，以SDAY液体培养基为基础培养基，加入5%、10%、20%、30%、40%的PEG200，以未加PEG200处理为对照，（25±1） ℃下培养12 h，于8 000 r/min离心10 min，弃上清液。孢子用灭菌水洗涤2次，同上离心，用0.05% Tween-80 分别配制成含孢子1×106个/mL的悬液，然后用直径7 mm的滤纸圆片浸没于孢子悬液中，再取出置于直径 9 cm 的SDAY平板中央，然后置于（25±1） ℃的培养箱中连续培养 7 d，每处理重复3次，逐日测量各平板上的菌落直径。

1.3高毒力白僵菌菌株抗紫外线能力的筛选

将各菌株的芽生孢子悬浮液（40～120个/μL）在室内紫外灯（30 W）下60 cm处照射0、0.5、1、2、4、6 min，吸取上述各处理的孢子悬浮液1 μL，均匀涂布于SDAY平板上，将平板置于（25±1） ℃ 温箱中培养，每个处理3次重复。培养 5 d 后计数各处理平板中菌落数，以未经处理的为对照，计算各菌株各处理的菌落死亡率，表示分生孢子的死亡率。

1.4高毒力白僵菌菌株耐高温能力的筛选

1.4.1短时高温处理对分生孢子的影响将芽生孢子悬浮液分装至试管，置于水浴锅恒温处理，处理温度设置：35、40、50、60、70 ℃，处理时间设置：10、20、30、40、50、60 min，以不加温处理为对照，3次重复。然后将处理的分生孢子分别：（a）转移至营养液，于26 ℃摇床恒温培养18～24 h，显微镜下观察5～10个视野，约500个孢子，计萌发率；（b）涂布于SDAY平板，25 ℃培养3 d，计成菌落数。

1.4.2持续高温培养对分生孢子的影响将芽生孢子悬浮液转移至营养液，分装至试管，置于水浴锅35、40、50、60、70 ℃ 恒温培养3～4 d，以25 ℃培养为对照，3次重复。涂布于SDAY平板，计成菌落数。

1.5高毒力白僵菌菌株耐低温能力的筛选

1.5.1高毒力白僵菌菌株低温下萌发率的测定取芽生孢子悬浮液，转移至营养液，分装至试管，在（15±1） ℃下培养，测定其萌发率。

1.5.2各菌株低温下生长量的测定取芽生孢子悬液 10 μL，滴于SDAY平板中央，每菌株设3个重复，置（25±1） ℃ 培养7 d，逐日测量菌落直径。

2结果与分析

2.1高毒力白僵菌菌株抗旱力的筛选

2.1.1高毒力菌株抗旱力的测定由表1可知，经不同浓度PEG200处理后，对不同菌株孢子萌发产生的影响不同。其中BD-B026菌株的抗旱力最高，对其孢子萌发的影响最小；BD-B017菌株次之，对BD-B007菌株影响最大。

2.1.2干旱胁迫下高毒力菌株生长量的测定由表2可知，不同菌株经不同浓度PEG200处理后，对孢子产生的影响随PEG200处理浓度的增大而增加。当处理浓度为20%时，各

菌株与未经PEG200处理间差异较明显。当处理浓度为40%时，各菌株之间存在显著性差异。其中40%PEG200对 BD-B029 的抑制率最高，BD-B021次之，BD-B026最小。表2不同菌株生长抑制率

菌株生长抑制率0%PEG200（CK）5%PEG20010%PEG20020%PEG20030%PEG20040%PEG200BD-B0260.00aA0.00aA0.01abA0.02abA0.03abA0.08bABD-B0100.00aA-0.02aA0.03abA0.01abA0.03abA0.10bABD-B0080.00aA0.00aA0.03aA0.05aA0.12aA0.13aABD-B0010.00aA0.00aA0.02aA0.04aAB0.12bBC0.14bCBD-B0170.00aA0.01abA0.04bcA0.07bcAB0.10cAB0.14dBBD-B0210.00aA0.00aA0.01bcAB0.10cABC0.15cdBC0.17dCBD-B0070.00aA-0.02aA0.00aA0.03aA0.09abAB0.18bBBD-B0290.00aA0.03aA0.05aA0.07aA0.17bAB0.21bB注：同行不同小写、大写字母表示差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。

2.2高毒力白僵菌菌株抗紫外线能力的筛选

不同菌株孢子经紫外光照射后，均对孢子产生影响，随紫外照射时间的增加而增大，且与未经照射孢子的萌发率之间均存在显著性差异。各菌株孢子间致死中时差异较明显（表3）。经紫外线照射后，其中BD-B008菌株孢子活率最低，对孢子的影响最大；BD-B007菌株次之，对BD-B17菌株影响最小。

2.3高毒力白僵菌菌株耐高温能力的筛选

2.3.1短时高温处理对分生孢子的影响温度通常关系到白僵菌孢子萌发和菌丝生长的速度，以及致病率的高低。尤其是高温，35 ℃是白僵菌营养生长的极限温度[9]。因此，孢子耐热性能是筛选优良菌株的重要指标之一，耐热性好表明菌株在野外抵抗高温的能力强。8个供试菌株经高温水浴处理后，18～24 h后孢子萌发结果见表4和表5。

菌株致死中时（min）回归方程BD-B0171.67±0.02 y=1.186 9+3.117 8xBD-B0101.04±0.03y=2.470 0+2.482 9xBD-B0260.77±0.04y=3.461 2+1.736 8xBD-B0290.64±0.04y=3.790 0+1.503 2xBD-B0010.63±0.05y=4.085 6+1.146 8xBD-B0210.58±0.03y=3.033 7+2.577 3xBD-B0070.47±0.03y=3.612 1+2.059 9xBD-B0080.06±0.08y=5.170 4+0.936 6x

2.3.1.135 ℃热胁迫对分生孢子的影响35 ℃处理后与对照有差异，得到的成菌落数均比观察到的发芽率略低，但热处理时间长短对发芽率和成菌落数的影响趋势基本相同（表4）。表4不同菌株分生孢子经35 ℃恒温水浴不同时间胁迫处理后的死亡率

菌株死亡率0 min10 min20 min30 min40 min50 min60 minBD-B0260.00aA0.03abAB0.06abcABC0.10abcdABC0.13bcdABC0.16cdBC0.19dCBD-B0170.00aA0.03abA0.11abcAB0.18bcAB0.21bcAB0.22cAB0.29cBBD-B0290.00aA0.08abA0.20abA0.23abA0.28abA0.31bA0.32bABD-B0080.00aA0.11abAB0.16abcAB0.21abcAB0.27bcAB0.33cB0.37cBBD-B0100.00aA0.02aA0.17bB0.23cC0.37dD0.46eE0.55fFBD-B0070.00aA0.10bB0.18cB0.31dC0.46eD0.52eD0.62 fEBD-B0010.00aA0.44abAB0.49abcAB0.52abcAB0.55bcAB0.59cB0.65cBBD-B0210.00aA0.32bB0.38cB0.52cB0.66dC0.69eD0.86fE注同表3。

菌株半致死时间

（LT50）（min）回归方程BD-B026126.88±0.05y=2.543 5+1.167 9xBD-B01793.85±0.04y=2.516 5+1.259 1xBD-B02953.49±0.02y=0.456 4+2.629 0xBD-B01052.57±0.03y=2.272 1+1.585 3xBD-B00837.34±0.03y=1.986 3+1.916 9xBD-B00736.48±0.03y=2.070 3+1.875 5xBD-B00123.39±0.03y=2.507 6+1.820 6xBD-B02115.77±0.05y=3.491 2+1.259 7x

2.3.1.240 ℃热胁迫对分生孢子的影响孢子的萌发在此温度下非常敏感，敏感程度依次为：BD-B026、 BD-B17、BD-B029、BD-B010、BD-008、BD-B007、 BD-B001、 BD-B021（表5）。BD-B021在处理10 min时，发芽率下降了32%。BD-B010和BD-B001对短时热处理有一定的忍耐力，当处理10 min时，发芽率与对照无显著差异，BD-B026 与其他菌株比较耐受能力较强，但处理时间为30 min时，发芽率也下降至21%以下。另外，成菌落数均比观察到的发芽率略低，但热处理时间长短对发芽率和成菌落数的影响趋势基本相同。

50 ℃、60 ℃和70 ℃处理对孢子萌发有很大抑制作用，各处理时段的发芽率均为0。

2.3.2持续高温处理对分生孢子的影响试验结果表明各菌株在各温度培养3～ 4 d均未形成菌落。

2.4高毒力白僵菌菌株耐低温能力的筛选

2.4.1高毒力菌株耐低温能力的测定结果不同菌株经低温处理，由于各菌株对低温的耐性不同，菌株之间存在十分明显的差异性。经低温处理48 h，BD-B008菌株孢子的萌发率最高，对孢子的影响最小，孢子萌发一半所需要的时间最短，对BD-B029菌株影响最大，孢子萌发一半所需时间最长。

菌株萌发中时（min）回归方程BD-B00834.47±0.02y=0.012 7+3.243 9xBD-B01036.15±0.02y=0.347 2+2.986 1xBD-B00737.78±0.02y=-0.139 1+43.258 2xBD-B01738.71±0.02y=0.217 8+3.011 7xBD-B00139.41±0.02y=0.456 3+2.847 7xBD-B02139.89±0.02y=-0.017 7+3.134 4xBD-B02639.01±0.02y=-0.068 7+3.185 5xBD-B02949.40±0.02y=10.461 6+2.679 5x

2.4.2各菌株低温下生长量的测定结果菌株营养生长快慢是反映菌株优良性状的指标之一。8个白僵菌菌株在SDAY 培养基上生长有明显的差异（表7）。7 d时菌落生长直径从11～1.4 cm不等，其中菌株BD-B008和BD-B001生长最快，BD-B021生长最慢。表7不同菌株低温下的菌落直径

菌株菌落直径（cm）1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 dBD-B0080.00aA0.56aA0.70aA0.88aA1.05aA1.18aA1.40aABD-B0010.00aA0.55aA0.70abA0.90abA1.00abAB1.20aA1.38abABBD-B0170.00aA0.60aA0.70abcA0.75abcAB0.83bcABC1.20aA1.33bcABCBD-B0070.00aA0.53aA0.65abcA0.73abcAB0.85cdBC0.95aA1.23bcdABCBD-B0260.00aA0.53aA0.75abcA0.78bcAB0.85cdBC1.05aA1.22bcdABCBD-B0290.00aA0.50aA0.60abcA0.70cAB0.80cdBC1.10aA1.20bcdABCBD-B0100.00aA0.53aA0.67bcA0.81cAB0.93cdC1.10aA1.15cdBCBD-B0210.00aA0.53aA0.62cA0.76cB0.85dC0.95aA1.10dC

2.5综合评判白僵菌菌株的生物学性状指标

综合评判8个白僵菌菌株的抗旱能力、耐热能力、抗紫外线能力和耐低温能力等生物学指标（表8）。从表8可知，对生物学性状指标进行综合评价后，BD-B017、BD-B010和BD-B026分别位列前3位，综合对小菜蛾的毒力考虑菌株BD-B026为首选开发菌株。表8不同菌株生物学指标综合评价

菌株抗旱能力抗旱生长

抑制率耐热能力抗紫外能力紫外生长

抑制率耐低温能力抗旱生长量综合排序BD-B017242124318BD-B026181357530BD-B010474242730BD-B007826713431BD-B029313478632BD-B008765861134BD-B021538636839BD-B001657585238

3结论与讨论

研究结果表明，不同菌株间抗逆性存在显著差异，同一菌株对不同条件的抗逆性也不相同。表明白僵菌孢子的稳定性除与温度、光照和湿度有关，还与孢子自身有关，所以今后在进行抗性育种和环境监测时，必须考虑这些因素，从而可以有效地预测孢子在环境中的宿存时间和数量，为防治策略的制定提供参考依据。综合考虑各项指标，BD-B017、BD-B010 和BD-B026有较大的生产应用潜力，这3个菌株的抗旱力、抗寒力、耐热力、抗紫外线能力等生物学特性，综合

排序位居前列，但菌株BD-B017对小菜蛾幼虫的毒力相对较低，最终得出防治小菜蛾幼虫优良菌株是BD-B026菌株。

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